[发明专利]一种从食醋发酵过程中提取微生物总基因组的方法

说明书

技术领域

本发明涉及传统食醋发酵过程样品中微生物总基因组的通用提取方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

中国传统食醋的酿造过程是微生物自然发酵的过程，其风味和口感与微生物产生的多种代谢产物(如有机酸、醇、酯等)密切相关。传统食醋的生产过程与微生物菌群的演替密切相关，主要包括淀粉糖化、酒精发酵和醋酸发酵三个阶段，其发酵状态可分为固态发酵、半固态发酵和液态发酵。在传统食醋生产过程中，稳定的微生物群落结构不仅决定了食醋生产的正常进行，而且保证了产品质量的稳定，通过分析食醋酿造过程中微生物群落的组成和丰度演替规律，对食醋生产监控具有重要的意义。目前关于传统食醋酿造工艺中微生物菌群的研究已经大量开展，但是这些研究也面临着关键的难题，由于环境中有99%的微生物无法在实验室中实现纯培养，仅采用传统的培养分离的研究方法很难检测出主要功能微生物的种类及丰度变化，食醋酿造过程中仍有大量可能具有重要功能的未培养微生物没有被发现。随着分子生态学技术(如变性梯度凝胶电泳DGGE/温度梯度凝胶电泳TGGE)、高通量测序和宏基因组学等技术的发展，使得研究未培养的微生物成为可能。这些基于基因序列分析的研究关键在于高质量的微生物总基因组的提取，以避免由于提取方法不当所造成的数据丢失，影响结果的准确性。目前已经报道的关于食醋的醋醅样品中微生物基因组提取方法多采用“液氮研磨+溶菌酶+SDS高盐抽提”法，该方法仅针对醋酸发酵阶段固态的醋醅样品中微生物基因组的提取进行优化，而由于醋醅的状态不同于其他发酵阶段的样品，如酒精发酵阶段液态的酒醪样品，因此这种提取方法并不适合食醋其他发酵阶段样品中微生物总DNA的提取。已经公布的类似的基因组提取专利，如中国专利《固态发酵微生物总DNA提取方法》(专利号：ZL2007100356764.4)，中国专利《一种从酱香白酒大曲中提取微生物真菌总DNA的方法》(专利申请号：200910228704.3)，中国专利《通过预处理获得高质量酒醅微生物基因组DNA的方法》(专利申请号：201210344426.X)，均是以固态的样品为研究对象，或以提取真菌的总DNA为目的，或针对酒醅样品做一系列预处理后再提取总DNA。然而，在食醋整体酿造过程中，各阶段的样品既有液态的又有固态的，且样品中有多种复杂微生物共存，这些方法不仅不能保证提取的质量和效果，而且存在一定的局限性。因此，开发一种高效通用的微生物总基因组提取方法对于进一步分析传统食醋发酵过程中微生物菌群的组成及演替规律具有重要意义。

发明内容

本发明目的是针对上述现有技术的不足，提供一种适合从传统食醋发酵过程中不同状态的食醋样品中提取微生物总基因组DNA的通用方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

①食醋发酵样品预处理：取液态或半固态样品0.2-5g在4℃6000-8000×g离心10-30min，弃上清，于-80℃预冻后，真空冷冻干燥，研磨样品至粉末状，待用；固态样品置于-20℃预冷的无菌研钵中，倾入液氮，研磨样品至粉末状，待用。

②微生物基因组DNA的抽提：向预处理后的样品中加入1.0mL-2.0mL DNA提取液，置于37℃的恒温振荡摇床在200-400rpm振摇15-30min后，加入质量比1%-5%的SDS(十二烷基硫酸钠)，充分混匀后置于65℃水浴锅中孵育1-3h，每15min-20min颠倒几下。向抽提液中加入1-2倍体积的PEG(聚乙二醇)8000(20%-40%，溶于1.6mol/L NaCl，体积比)室温放置1-2h，10000-12000×g离心10-30min，弃上清，将沉淀溶于1-2mL TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA,pH8.0),加入乙酸钾(3-5mol/L)溶液,4℃放置15-60min，12000-15000×g离心10-20min，取上清，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液(酚∶氯仿∶异戊醇体积比25∶24∶1)，12000-15000×g离心10-30min。

③除杂及漂洗浓缩：吸取步骤②DNA抽提后的上清水相，加入等体积的氯仿-异戊醇混合液(氯仿∶异戊醇体积比24∶1)，混合，12000-15000×g离心5-10min，吸取上清，加入醋酸铵-异丙醇混合液，-20～-80℃放置1-3h沉淀DNA，12000-15000×g离心10-20min，弃上清，取沉淀。用预冷的70%乙醇漂洗沉淀，12000-15000×g离心5-10min，弃上清，室温放置，直至乙醇挥发完全，加入50-100μL双蒸水溶解沉淀，得到微生物基因组总DNA。