[发明专利]一种双片苣苔组织培养及快速繁殖的方法

说明书

技术领域：

本发明属于植物繁殖领域，具体涉及一种双片苣苔组织培养及快速繁殖的方法。

背景技术：

双片苣苔（Didymostigma obtusum（Clarke）W.T.Wang），是苦苣苔科双片苣苔属多年生草本，分布于福建、广东、广西和海南，喜欢生长在荫蔽的溪边，在野外不常见，居群数量较少，被《中国的珍稀植物》收录（邢福武，2005），双片苣苔叶片两面有柔毛，叶背紫红色，开蓝紫色的花，有较高观赏价值，适合做地被观赏植物。

双片苣苔组织培养和快速繁殖的技术，国内外均未见报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种成活率高，能快速、简单、有效的繁殖并能大量得到双片苣苔幼苗的双片苣苔组织培养及快速繁殖的方法。

本发明的双片苣苔组织培养及快速繁殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、外植体消毒处理：以双片苣苔（Didymostigma obtusum（Clarke）W.T.Wang）植株叶片为外植体，先用清水将外植体冲洗干净，消毒后再无菌水冲洗干净，得到消毒后的外植体；

b、不定芽的初代诱导：将消毒后的外植体接种到诱导培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m^-2·s^-1、光照时间12h·d^-1的条件下，培养30天，叶片外植体诱导形成不定芽，所用的诱导培养基为：每升含有TDZ（N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲）2.0～3.0μmol、NAA（萘乙酸）0.2μmol、蔗糖30g、琼脂5.5g，其余为MS培养基，pH为5.6，诱导系数为44.6；

c、芽的继代增殖：将不定芽丛切成块，转入继代的培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m^-2·s^-1、光照时间12h·d^-1的条件下，培养30天，从生芽生长健壮成芽苗，所用的继代的培养基为：每升含有BAP（苄氨基嘌呤）0.5μmol、蔗糖30g、琼脂5.5g、其余为MS培养基，pH为5.6；

d、生根培养：将高3cm的芽苗分切转入生根培养基上，在温度25±1℃、光照强度50μmol·m^-2·s^-1、光照时间12h·d^-1的条件下，培养20天后，生根的试管苗形成，所述的生根培养基为：每升含有IBA（3-吲哚丁酸）2.0～4.0μmol、NAA（萘乙酸）2.0μmol、蔗糖30g、琼脂5.5g、其余为1/2MS培养基，pH为5.8；

e、试管苗移栽：将长好根的试管苗移栽到移栽基质中，放置于遮荫温室中培养，浇水保湿，其他按常规条件进行培养，由此得到双片苣苔幼苗，所用的移栽基质为：腐质土和黄泥土按质量比1∶1混合均匀。

所述的双片苣苔优选为野生的双片苣苔。

所述的消毒优选为使用质量分数1%NaClO溶液消毒10～11分钟。

所述的MS培养基为国际通用的培养基，其成份和配置方法可参考书籍(谭文澄、戴策刚主编.观赏植物组织培养技术.北京：中国林业出版社，1991.)，所述的1/2MS是将MS中的大量元素浓度减半，而其他成分浓度不变而形成的培养基。

本发明以双片苣苔叶片为外植体，通过筛选和优化初代诱导、继代增殖、生根和移栽培养基配方和培养条件，经过不定芽的初代诱导、继代增殖和生根培养以及试管苗的移栽阶段，实现珍稀观赏植物双片苣苔种苗的快速繁殖，一般只需110天就可以获得双片苣苔的幼苗，并且双片苣苔幼苗的成活率可达95%以上，移栽后90天内可开花结果。因此本发明具有简单、快速和有效的特点，可以直接用于双片苣苔的繁育和保护，从而为该物种的遗传改良、种质资源保护和开发利用奠定基础。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

a、外植体消毒处理：以广东省南昆山石河奇观景区的野生双片苣苔（Didymostigma obtusum（Clarke）W.T.Wang）植株叶片为外植体，先用清水将外植体冲洗干净，再使用质量分数1%NaClO溶液消毒10分钟，无菌水冲洗5遍冲洗干净，得到消毒后的外植体；