[发明专利]密码子优化的Cry1Ca#基因与重组载体以及改变作物抗性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体地，涉及一种密码子人工优化设计的Cry1Ca^#基因、一种重组载体和一种改变作物抗性的方法。

背景技术

来自于苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）的Bt基因编码的杀虫晶体蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目等多种昆虫具有特异性的杀虫活性。Bt基因已成为植物基因工程及转基因育种中应用最广泛、最有效的抗虫基因。1981年，Schnepft和Whiteley首次成功地克隆了第一个编码Bt杀虫蛋白基因Cry1Aa，迄今为止，已先后分离并克隆了600多个杀虫蛋白基因。研究较为深入的是Cry1类基因，它编码130kD的杀虫晶体蛋白，主要对鳞翅目昆虫有毒，其中Cry1C类基因编码的134kD的晶体蛋白对鳞翅目和双翅目均有毒性。

来自于细菌的原始Bt基因中存在很多在真核生物中导致表达不稳定的元件，如类似植物的poly(A)信号序列、内含子切割信号位点、富含AT的序列等，可导致基因编码的mRNA不稳定；与植物基因相比，细菌的原始Bt基因G/C含量和密码子的使用频率都有很大差异，不适合在植物中高效表达。虽然通过将原始Bt基因转化植物获得了转基因烟草（Vacek et al.,Transgenic plants protected from insect attack.Nature,1987,328:33-37；Adang et al.,Application of a Bacillus thuringiensis crystal protein for insect control.In:Amtzen C J,Ryan C,eds.,Molecular strategies for crop protection.New York,USA,1987,pp.345-353；Barton et al.,Bacillus thuringiensisδ-endotoxin expressed in transgenic Nicotiana tabacum provides resistance to lepidopteran insects.Plant Physiology,1987,85:1103-1109）、番茄（Fischhoff et al.,Insect tolerant transgenic tomato plants.Biotechnology,1987,5:807-813）、棉花（Perlak et al.,Insect resistance cotton plants.Biotechnology,1990,8:939-943）等转基因植物，但Bt杀虫蛋白（Insecticidal Crystal Protein,ICP）在植物中的表达水平普遍偏低，抗虫效果也较差，毒蛋白的含量只占可溶性蛋白的0.001％或低至无法检测的水平，难以满足生产应用的要求。1990年以后对Bt基因的改造研究逐步深入，修饰改造的CrylA(b)和CrylA(c)在转基因棉花（Gossypium hirsutum L.）中的表达水平大大提高，杀虫蛋白含量为植株可溶性总蛋白的0.05-0.1%，达到了抗虫目的，从而使转Bt基因作物在农业生产上的应用成为可能。人工改造合成的CrylC在转基因紫花苜蓿（Medicago sativa L.）和烟草中表达的杀虫蛋白含量为可溶性总蛋白的0.01-0.2%，并对灰翅夜蛾（Spodoptera littoralis）和甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）表现出较高水平的抗性（Strizhov et al.,A synthetic cryIC gene,encoding a Bacillus thuringiensisδ-endotoxin,confers Spodoptera resistance in alfalfa and tobacco.Proceedings of the National Academy of Sciences,1996,93:15012-15017）。Zaidi等（Zaidi et al.,Transgenic Rice Plants Expressing a Modified cry1Ca1 Gene are Resistant to Spodoptera litura and Chilo suppressalis.Molecular Biotechnology,2009,43:232-242.）将按照水稻偏爱密码子改造的CrylCa1基因导入粳稻秀水11中，获得的转基因植株对斜纹夜蛾（Prodenia litura）和二化螟（Chilo suppressalis）表现高度抗性，转基因植株中杀虫蛋白为可溶性总蛋白的0.34%。Tang等（Tang et al.,Development of insect-resistant transgenic indica rice with a synthetic Cry1C*gene.Molecular Breeding,2006,1(18):1-10）和Ye等（Ye et al.,Development of insect-resistant transgenic rice with Cry1C*-free endosperm.Pest Management Science,2009,9(65):1015-1020）分别将按照植物偏爱密码子人工修饰改造后的CrylC*基因导入籼稻恢复系明恢63和粳稻中花11号中，转基因后代及其杂交种对稻纵卷叶螟和水稻螟虫表现为高度抗性，ELISA检测转基因水稻明恢63在抽穗期Bt蛋白含量为1.38μg/g叶片鲜重；转基因水稻中花11号在分蘖期Bt蛋白含量为0.87-3.13μg/g叶片鲜重，在灌浆期Bt蛋白含量为0.71-0.86μg/g叶片鲜重。