[发明专利]小鼠肝脏原代细胞分离方法无效
| 申请号： | 201310303792.5 | 申请日： | 2013-07-18 |
| 公开（公告）号： | CN103396983A | 公开（公告）日： | 2013-11-20 |
| 发明（设计）人： | 宁光;李博;李小英;洪洁;王卫庆;杨颖;张志国 | 申请（专利权）人： | 上海交通大学医学院附属瑞金医院 |
| 主分类号： | C12N5/071 | 分类号： | C12N5/071 |
| 代理公司： | 上海伯瑞杰知识产权代理有限公司 31227 | 代理人： | 韩国辉 |
| 地址： | 200025 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 小鼠 肝脏 细胞 分离 方法 | ||
【权利要求书】：
1.一种小鼠肝脏原代细胞分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）配制Ⅳ型胶原酶：称取0.0125gⅣ型胶原酶加入盛有20mL的Hanks培养液中，配制成终浓度为0.05%的Ⅳ型胶原酶，0.45μM滤器过滤，放入37℃水浴锅中温育；
（2）取一只准备好的小鼠麻醉，肌注肝素抗凝；
（3）固定，剪开皮毛，用棉签将肠胃向右拨开，露出门静脉，用细弯镊游离门静脉，垫入细线，上下各1根；
（4）用10mL注射器吸取已预热的无钙D-Hanks，连接至套管针；
（5）向门静脉中插入套管针，拔出一点针头，结扎细线固定针；
（6）推入无钙D-Hanks6-9mL，同时用棉签轻拍肝脏，至肝脏变白；
（7）剪下肝脏，放入10cm平皿中，用10mL注射器吸取胶原酶，缓缓推入，同时用棉签轻拍肝脏，观察肝脏的变化，重复4-5次，待肝脏包膜破裂，用镊子撕扯包膜；
（8）将撕碎的肝脏用100目筛网滤入50mL离心管中，500rpm，4℃离心5min；
（9）弃上清，加入1×PBS20mL重悬，混匀离心，此步骤重复3次；
（10）加入原代细胞培养液hepatocyte medium，接种至12孔细胞板中培养；
（11）24h后换高糖DMEM培液。
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