[发明专利]一种提高橡胶草花青素含量的方法

权利要求书

1.一种提高橡胶草花青素含量的方法，其特征在于采用基因克隆方法获得拟南芥花青素合成调控因子1基因全长，将拟南芥花青素合成调控因子1基因与植物表达载体构建重组表达载体，重组表达载体阳性质粒导入到根癌农杆菌中，采用根癌农杆菌介导转化橡胶草，获得高花青素转基因橡胶草，并将转基因橡胶草植株进行检测。

2.按照权利要求1所述的一种提高橡胶草花青素含量的方法，其特征在于采用基因克隆方法获得拟南芥花青素生成转录因子1基因全长，以拟南芥基因组DNA为模版，采用含有XbaI上游引物5'-ACTCTAGAATGGAGGGTTCGTCCAAAGG-3'，以及含有SacI的下游引物5'–CCGAGCTCCTAATCAAATTTCACAGTCTC-3'，经聚合酶链式反应（PCR）扩增，获得的扩增产物于1%的琼脂糖凝胶电泳进行分离，目标片段回收后与Vector载体连接，转入大肠杆菌DH5α，测序验证并得到所述基因的编码序列。

3.按照权利要求1所述的一种提高橡胶草花青素含量的方法，其特征在于将拟南芥花青素合成调控因子1基因与植物表达载体构建重组表达载体的方法为，用XbaI和SacI双酶切所述的拟南芥花青素生成转录因子1基因的PCR回收产物和pBI121植物表达载体，回收连接转化DH5α，挑取单克隆，提取质粒做聚合酶链式反应检测和酶切验证，得到含有所述基因的重组表达载体。

4.按照权利要求1所述的一种提高橡胶草花青素含量的方法，其特征在于采用根癌农杆菌介导转化橡胶草的方法为，挑取含有重组表达载体的根癌农杆菌单菌落，接种于10mL无抗生素的YEB液体培养基中，28°C180r/min振荡培养16小时，5000r/min离心10min收集菌体；农杆菌用50ml MS液体培养基稀释到OD560=0.5-0.8。将橡胶草叶片切成1～2cm²，浸染橡胶草叶片5～30分钟，取出叶片愈伤组织，将其表面的菌液用滤纸吸干，转移到MS培养基上。共培养2～3天后，将外植体从原培养基上取出，转接到分化培养基上，每10～20天更换一次分化培养基。待抗性芽长到0.5cm左右时，将抗性芽切下，转入生根培养基培养进行生根，获得抗性的再生橡胶草植株。

5.按照权利要求1所述的一种提高橡胶草花青素含量的方法，其特征在于转基因橡胶草植株进行检测是将抗性的再生橡胶草植株移栽到1:1的蛭石：草炭土，清水常规管理。CTAB法提取上述植株的基因组DNA，设计基因特异检测引物，分别为RT-F：5'-TTGCTGGAAGATTACCTGGT-3'和RT-R：5'-TCCAAAGTTGATCAACGTCA-3'；扩增目的基因产物450bp。用转基因株系叶片总DNA为模板，检测筛选阳性转基因植株，筛选出高花青素转基因橡胶草。