[发明专利]一种提高肌氨酸氧化酶稳定性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高肌氨酸氧化酶稳定性的方法，属于酶工程领域。

背景技术

肌氨酸氧化酶（sarcosine oxidase，E.C.1.5.3.1）简称SOX，是肌酐降解代谢途径中的第三个酶，能专一性地催化底物肌氨酸生成甘氨酸。微生物是肌氨酸氧化酶最为主要的来源，其在临床诊断中有广泛的应用，通过肌氨酸氧化酶偶联肌酐酶、肌酸酶测定血清中肌酐的含量，是判断肾脏功能的一个重要参考指标，在医药领域具有良好的应用前景。

由于肌氨酸氧化酶在保存、运输过程中易失活，因此提高其稳定性是该酶大量应用的基础。目前，提高酶稳定性方法主要有，蛋白质工程、固定化、添加保护剂、化学修饰等，其中固定化是较为常用的方法。戊二醛作为双功能试剂，广泛应用于酶固定化中，但考虑到操作复杂且试剂具有毒性，本发明中使用碳二亚胺法固定肌氨酸氧化酶，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)是一种将氨基和羧基偶联的缩合剂，酶分子羧基被碳二亚胺活化，生成中间产物，该产物再与氨基载体反应形成结合物。

发明内容

本发明的目的是克服了上述现有技术中的缺点，提供提高肌氨酸氧化酶稳定性的方法，本发明设计巧妙、条件温和、易操作、成本低、环境污染小、适于大规模应用。

本发明的技术方案：一种提高肌氨酸氧化酶稳定性的方法，以多聚赖氨酸poly-lysine为氨基载体，选用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺EDC为交联剂，对肌氨酸氧化酶进行固定化处理，固定化条件为：酶分子表面羧基与载体氨基摩尔比1:10-80，酶分子表面羧基与EDC摩尔比为1:1-2，固定化pH为6.5-8.0，固定化温度为4-10℃，50 r/min固定化时间为16-20h。

优选的固定化条件为：酶分子表面羧基与载体氨基摩尔比1:50，固定化pH为6.5。

在固定化之前需要研究肌氨酸氧化酶分子表面酸性氨基酸数目，所述单个肌氨酸氧化酶分子表面酸性氨基酸数目为49个。

较佳地，固定化处理以多聚赖氨酸为氨基载体。

较佳地，氨基载体的氨基密度为27mol/g。

较佳地，所述酶分子表面羧基与载体氨基摩尔比1:50，酶分子表面羧基与EDC摩尔比为1:2，所述固定化pH为6.5。

所述固定化酶的热、pH和存储稳定性均优于游离酶。

本发明的有益效果：

1、本发明在固定化前，分析了肌氨酸氧化酶分子表面酸性氨基酸分布情况，便于其后进行固定化；

2、本发明以多聚赖氨酸为氨基载体；

3、本发明优化了肌氨酸氧化酶固定化条件，增强了操作的精确性。

采用本发明的方法肌氨酸氧化酶的热、pH和存储稳定性得到了显著提高。因此，采用本发明可以显著提高肌氨酸氧化酶稳定性，为该酶的进一步应用提供了坚实的基础。

综上，本发明的提高肌氨酸氧化酶稳定性方法设计巧妙、条件温和、易操作、成本低、环境污染小、适于大规模应用。

附图说明

图1是多聚赖氨酸固定化SOX过程图

图2是肌氨酸氧化酶分子表面酸性氨基酸分布图

图3是不同pH对固定化SOX活力的影响

图4是酶分子表面羧基与EDC摩尔比对固定化SOX活力的影响

图5是游离SOX酶和固定化SOX酶的热稳定性比较

图6是游离SOX酶和固定化SOX酶的pH稳定性比较

图7是游离SOX酶和固定化SOX酶的存储稳定性比较。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。

实施例1 肌氨酸氧化酶羧基与载体氨基摩尔比对固定化SOX酶活力的影响：

取6个离心管，每管中各称取多聚赖氨酸氨基载体1 g于15 mL的离心管中，按照酶分子表面羧基与EDC摩尔比1:10、肌氨酸氧化酶表面羧基与多聚赖氨酸氨基不同的摩尔比（1:5、1:10、1:50、1:80、1:100、1:150）加入EDC和肌氨酸氧化酶的量，加入磷酸缓冲液至溶液总体积为10mL，调节溶液pH至7.0，4-10 ℃、50 r/min振荡固定16-20h。测定固定化SOX酶活力，计算相对酶活力(%)。

将不同固定化SOX酶置于37℃水浴锅内，7d后测定酶活力，计算酶活保留率(%)。

摩尔比过高，酶分子紧密堆积抑制底物与酶活性部位反应，造成酶活力下降，所以，肌氨酸氧化酶表面羧基与载体氨基摩尔比为1:10-80，尤以1:50对稳定性作用最佳，结果见表1。