[发明专利]用于鉴定金花茶的SNP分子标记及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及用于鉴定金花茶的SNP分子标记及其应用。 

背景技术

金花茶(Camellia nitidissima Chi)属于山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)金花茶组(Sect.chrysantha)的常绿灌木，因其花冠呈黄色而具有重要的园艺价值，被誉为“茶花皇后”。近年来，由于栖息地的丧失，濒危物种资源的过度采集和非法出口贸易，其自然种群急剧下降。金花茶被列为国家一级重点保护植物，IUCN红色名录中最濒危的植物种类之一。因此，建立准确的金花茶植物鉴定方法是其生物多样性保护和研究的关键。 

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是指在基因组水平上由于单个核苷酸的转换、颠换、插入或缺失等所引起的碱基序列多态性，与其它类型分子标记相比具有数量丰富、分布广泛、遗传稳定性高、易实现自动化分析等优势(Mochida et al.,2003)。目前SNP的检测分析方法，如：DNA直接测序法、基因芯片技术、阵列杂交分析、高效变性液相色谱检测等(Jehan and Lakhanpaul,2006)，但是由于技术繁琐、成本高，限制了其应用。酶切扩增多态性（cleaved amplified polymorphic sequence,CAPS）标记是根据SNPs位点的DNA序列设计特异的PCR引物，与限制性内切酶相结合产生的一种分子标记。但SNP恰好位于限制性酶切位点这种情况比较少，为了更有效地检测SNPs，衍生酶切扩增多态性（derived cleaved amplified polymorphic sequence,dCAPS）技术在CAPS标记基础上通过在引物中引入错配碱基，结合SNP位点引入新的限制性内切酶位点，从而达到 酶切检测SNPs的目的(Michaels and Amasino,1998)。dCAPS技术自发明以来大量应用于分子遗传学及种质资源品种品系鉴定等方面研究，该技术已在水稻(Komori and Nitta,2005)、拟南芥(Nemri et al.,2007;Hou et al.,2010)、小麦(Yanagisawa et al.,2003)、大麦(Shahinnia and Sayed-Tabatabaei,2009)、葡萄(Boss and Thomas,2002)、香蕉(P.UMALI and NAKAMURA,2003)、山茶(张成才等，2012)等作物中得到了广泛的应用。 

发明内容

本发明的目的是提供一种基于金花茶SNP位点建立dCAPS分子标记体系，从而快速鉴定金花茶物种的方法。 

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于鉴定金花茶的SNP分子标记，其位于如SEQ ID NO.1所示的金花茶GBSSI基因的第141位碱基，此处碱基为T，则鉴定为金花茶物种。 

本发明还提供所述SNP分子标记在金花茶分子标记辅助育种中的应用。 

本发明还提供用于PCR检测金花茶的特异性引物对，包括上游引物F5’-CTGTGGACGCAAACATCCACTTGAT-3’和下游引物R5’-CCATGTATTTCTTGCCAGTGCCCT-3’。 

本发明还提供一种鉴定金花茶的方法，包括以下步骤：1）提取待测植物的基因组DNA；2）以待测植物的基因组DNA为模板，利用上述引物F和R，PCR扩增金花茶GBSSI基因；3）检测PCR扩增产物。 

具体地，步骤3）中采用酶切法检测PCR扩增产物，酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果呈现2条带，则待测植物为金花茶物种。其中，酶切使用的限制性内切酶为BstXI。 

前述方法中，25μL PCR反应体系中包括：添加Mg²⁺的10×EX Taq缓冲液2.5μL，2.5mM dNTPs2μL，10μM上、下游引物各1μL，5U/μL EX Taq DNA聚合酶0.2μL，50μg/μL基因组DNA1μL，余量为ddH₂O。 

前述方法中，PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。 

本发明还提供含有所述引物F和R的用于检测金花茶的试剂盒。优选所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、标准阳性模板等中的一种或多种。