[发明专利]检测植物花器官特异性DNA甲基化修饰位点的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体而言，涉及一种检测植物花器官特异性DNA甲基化修饰位点的方法及试剂盒。 

背景技术

DNA甲基化在植物发育过程以及基因组防御环境因子胁迫等方面扮演重要的作用（et al.2004;Ruiz-Garcia et al.2005;Teyssier et al.2008; Verhoeven et al.2010）。在植物中，DNA甲基化通常发生在CpG或者CpNpG序列上，并且在DNA修复的循环中可以维持不变（Wassenegger2000）。所有的植物发育过程都建立在精准的时空特异表达和基因表达调控的基础之上。越来越多的证据表明基因表达的时空特异性不仅由特异的DNA序列（顺式以及反式作用元件控制）调控，还由一些表观修饰因子，其中最主要的就是DNA甲基化（Chan et al.2005）进行调控。 

目前，对基因组甲基化进行研究最常用的技术是甲基敏感扩增多态性技术（Methylation sensitive amplified polymorphism，MSAP），该方法是利用识别CpG或者CpNpG的两种DNA甲基化敏感酶（Hpa Ⅱ和Msp Ⅰ），对全基因组的DNA甲基化修饰位点进行识别，再利用PCR对酶切片段进行扩增，结合聚丙烯酰胺凝胶电泳显示DNA甲基化修饰差异片段。MSAP技术可以对全基因组DNA甲基化修饰位点进行检测，具有高效、省时、准确以及不依赖基因组已知信息的优点。因此，该方法得到广泛应用并迅速发展，在生命科学领域具有广泛的应用价值。 

由于MSAP技术需要利用两种DNA甲基化敏感酶进行酶切反应，因此为得到在植物不同组织通用的反应体系，需要针对酶、DNA模板、反应时间以及温度进行优化。但是传统的MSAP方法只能获得DNA甲基化差异位点，无法获得该位点的核苷酸序列，不利于后续研究的开展。 

发明内容

本发明旨在提供一种检测植物花器官特异性DNA甲基化修饰位点的方法及试剂盒，以解决传统的MSAP方法在植物花器官中应用效果差以及无法获得差异位点的核苷酸序列的技术问题。 

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种检测植物花器官特异性DNA甲基化修饰位点的方法。该方法采用MSAP技术检测DNA甲基化，包括以下步骤：S1，提取植物花器官基因组DNA；S2，分别用Msp I/EcoRI和Hpa II/EcoRI两组酶对植物花器官基因组DNA进行酶切；S3，分别对酶切产物连接上限制性内切酶的接头；S4，以接头为模板设计的 预扩增引物进行PCR预扩增，得PCR预扩增产物；S5，将PCR预扩增产物稀释后，加入带有选择性碱基的筛选引物进行PCR扩增；S6，电泳检测PCR扩增产物，统计并分析DNA条带，S7，回收、克隆S6中得到的DNA甲基化差异条带并进行测序，其中，接头包括EcoRI接头和HpaII/MspI接头，EcoRI接头的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，HpaII/MspI接头的序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；预扩增引物包括EcoRI预扩增引物和HpaII/MspI预扩增引物，EcoRI预扩增引物的序列为SEQ ID NO：5，HpaII/MspI预扩增引物的序列为SEQ ID NO：6；筛选引物包括EcoRI筛选引物和HpaII/MspI筛选引物，EcoRI筛选引物序列为SEQ ID NO：7～16，HpaII/MspI筛选引物序列为SEQ ID NO：17～27。 

进一步地，S2中的酶切体系为20μl酶切体系，包括10×扩增缓冲液2.0μl，DNA4.0μl，EcoRI/HpaII3U/3.2U或EcoRI/MspI3U/4U，EcoRI接头0.5μl，HpaII/MspI接头0.5μl，T4连接酶0.5μl，ddH₂O11.85μl。 

进一步地，S4中的预扩增体系为25μl体系，包括稀释100倍的酶切产物2.5μl，浓度为10μmol/L的预扩增引物19.5μl，10×扩增缓冲液2.5μl。 

进一步地，S4中的预扩增程序为94℃变性2min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸80s，30个循环，最后72℃延伸5min。