[发明专利]检测植物花器官特异性DNA甲基化修饰位点的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种检测植物花器官特异性DNA甲基化修饰位点的方法，其特征在于，采用MSAP技术检测DNA甲基化，包括以下步骤：

S1，提取植物花器官基因组DNA；

S2，分别用Msp I/EcoRI和Hpa II/EcoRI两组酶对所述植物花器官基因组DNA进行酶切；

S3，分别对酶切产物连接上限制性内切酶的接头；

S4，以所述接头为模板设计的预扩增引物进行PCR预扩增，得PCR预扩增产物；

S5，将所述PCR预扩增产物稀释后，加入带有选择性碱基的筛选引物进行PCR扩增；

S6，电泳检测PCR扩增产物，统计并分析DNA条带，

S7，回收、克隆所述S6中得到的DNA甲基化差异条带并进行测序，

所述接头包括EcoRI接头和HpaII/MspI接头，所述EcoRI接头的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，所述HpaII/MspI接头的序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；所述预扩增引物包括EcoRI预扩增引物和HpaII/MspI预扩增引物，所述EcoRI预扩增引物的序列为SEQ ID NO：5，所述HpaII/MspI预扩增引物的序列为SEQ ID NO：6；所述筛选引物包括EcoRI筛选引物和HpaII/MspI筛选引物，所述EcoRI筛选引物序列为SEQ IDNO：7～16，所述HpaII/MspI筛选引物序列为SEQ ID NO：17～27。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S2中采用的酶切体系为20μl酶切体系，包括10×扩增缓冲液2.0μl，DNA4.0μl，EcoRI/HpaII3U/3.2U或EcoRI/MspI3U/4U，EcoRI接头0.5μl，HpaII/MspI接头0.5μl，T4连接酶0.5μl，ddH₂O11.85μl。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S4中的预扩增体系为25μl体系，包括稀释100倍的所述酶切产物2.5μl，浓度为10μmol/L的所述预扩增引物19.5μl，10×扩增缓冲液2.5μl。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S4中的预扩增程序为94℃变性2min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸80s，30个循环，最后72℃延伸5min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S5中的选择扩增体系为20μl扩增体系，包括PCR扩增混合液10μl，稀释100倍的所述PCR预扩增产物3μl，HpaII/MspI引物1μl，EcoRI引物1μl，ddH₂O5μl，其中，所述PCR扩增混合液包括ddH₂O155.0μl，10×扩增缓冲液40.0μl，5U Taq DNA聚合酶5μl。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S5中的选择扩增程序为94℃变性5min，94℃变性30s，65℃且每个循环退火温度降0.7℃退火30s，72℃延伸1min，13个循环后；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸80s，23个循环，72℃延伸5min。