[发明专利]一种检测布鲁氏菌的LAMP引物及包含该引物的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速检测布鲁氏菌的方法以及LAMP引物及包含该引物的试剂盒，属于微生物检测技术领域。 

背景技术

布鲁氏菌（Brucella spp.）是一种革兰氏阴性菌，无鞭毛，无芽孢，光滑有荚膜。常在细胞内寄生。内毒素是其重要的致病物质。布鲁氏菌可通过完整皮肤和粘膜进入宿主，具有较强的侵袭力。根据表型，抗原性及宿主的不同，布鲁氏菌被分为6各种，分别是Brucella abortus(牛种布鲁氏菌),Brucella melitensis(羊种布鲁氏菌),Brucella ovis(绵羊附睾种布鲁氏菌),Brucella canis(犬种布鲁氏菌),Brucella suis(猪种布鲁氏菌)and Brucella neotomae(沙林鼠种布鲁氏菌)；感染人类的主要是牛种布鲁氏菌，羊种布鲁氏菌和猪种布鲁氏菌。长久以来，布鲁氏菌一直被列为潜在的生物武器。 

布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌引起的一种重要的人兽共患传染病，在许多国家引起了严重的公共健康问题和农业经济问题。该病可以导致许多家畜和野生动物流产和不育；人类感染布鲁氏菌的临床症状表现为发热(波浪热)、寒战、头痛、全身疼痛、疲劳、脑神经功能障碍症状、关节炎等非特异性症状。 

由于布鲁氏菌病的临床症状是非特异性的，并且变化无常，因此必须借助实验室诊断技术对布鲁氏菌病进行最后的确诊。细菌学检测是必要的，但是细菌在培养基中生长较慢，并对实验室工作人员有危险；血清学诊断虽然比较简单，但是特异性比较低，因为布鲁氏菌的脂多糖与其他病原菌的脂多糖（如小肠结肠炎耶氏菌）存在结构相似性，因此容易产生交叉反应；基于DNA的PCR检测方法敏感，准确，快速，可以替代病原学检测，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。因此，迫切需要开发出一种可以快速、特异、简单、安全地检测布鲁氏菌病的方法。 

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中无法快速、准确的检测布鲁氏菌的不足，提供一种可以快速、特异、简单、安全地检测布鲁氏菌的方法； 

进一步的，本发明提供了一种能够快速检测布鲁氏菌的LAMP引物以及包含该引物的试剂盒。 

为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的： 

一种用于检测布鲁氏菌的LAMP引物，其特征在于，所述LAMP引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向内引物FIP、核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反向内引物BIP、核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的正向外引物F3以及核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的反向 外引物B3。 

所述LAMP引物还包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6所示的环引物LF1和LB1，或者核苷酸序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的环引物LF2和LB2。 

一种用于检测布鲁氏菌的试剂盒，包括：权利要求1或2所述的LAMP引物、Bst DNA聚合酶、含dNTPs的反应缓冲液和去离子水; 

其中，所述含dNTPs的反应缓冲液包含40mM pH8.8的Tris-HCl、20mM KCl、20mM(NH₄)₂SO₄、16mM MgSO₄、0.2%吐温20、1.6M甜菜碱以及2.8mM dNTPs 

所述试剂盒包括40pM/μL引物FIP100μL，40pM/μL引物BIP100μL，5pM/μL引物F3100μL，5pM/μL引物B3100μL，20pM/μL引物LF1或LF2100μL，20pM/μL引物LB1或LB2100μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶100μL，含dNTPs的反应缓冲液1.5mL，去离子水1mL。 

一种利用权利要求3所述的试剂盒检测布鲁氏菌的方法，包括如下步骤： 

S01：制备模板DNA； 

S02：以S01中所得的DNA作为模板，采用权利要求1或2所述的LAMP引物，于60℃～65℃进行LAMP扩增反应，反应时间为55min～90min；所述LAMP扩增反应的体系为25μL，各组分的含量如下： 

或者 

S03:扩增结果判定。