[发明专利]一种基于特异引物鉴定5种常见储粮扁谷盗的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于鉴定或辅助鉴定5种常见储粮扁谷盗的试剂盒。

背景技术

扁谷盗隶属于鞘翅目（Coleoptera）、扁谷盗科（Laemophloeidae）、扁谷盗属（Cryptolestes），该属国内外共记述有20余种，其中危害储粮的扁谷盗约为10种，在世界范围内分布较为广泛的为锈赤扁谷盗、长角扁谷盗、土耳其扁谷盗和开普扁谷盗等5种。

鞘翅目昆虫在储粮害虫中数量最大、种类最多、检疫意义最突出，扁谷盗即是鞘翅目储粮害虫中具有重要经济意义的一个类群，其幼虫和成虫可危害谷物、豆类、油料等多种农产品与其加工产品，大量发生时能造成较为严重的经济损失，主要通过农副产品的贸易进行跨境传播。近年来，我国进出境检验检疫部门截获的扁谷盗批次明显增多。明确口岸截获和粮库发生的储粮扁谷盗种类，对检疫决策制定和有害生物治理具有十分重要的意义。由于扁谷盗个体微小（体长2mm左右）且种间外部形态极为相似等原因，传统的形态学鉴定技术仅能鉴定具有明显特征形态的成虫，对鉴定人员的形态分类学技术要求较高，并不能满足快速、准确鉴定扁谷盗种类的需求。

近几年发展起来的分子生物学鉴定方法主要包括同工酶电泳技术、限制性片段长度多态性分析（RFLP）技术、随机扩增DNA多态性分析(RAPD)技术、核酸序列分析技术及特异引物PCR技术。限制性片段长度多态性PCR技术结果较为准确，但筛选所需限制性内切酶种类的工作量较大。截至目前，未见针对锈赤扁谷盗、长角扁谷盗、微扁谷盗、土耳其扁谷盗和开普扁谷盗这5种世界常见储粮扁谷盗的分子鉴定技术的报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定储粮扁谷盗的试剂盒。

本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定储粮扁谷盗的试剂盒，可包括如下5个引物对中的至少一对：

（1）由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对1；

（2）由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2；

（3）由序列表中序列5和序列6所示的两条单链DNA组成的引物对3；

（4）由序列表中序列7和序列8所示的两条单链DNA组成的引物对4；

（5）由序列表中序列9和序列10所示的两条单链DNA组成的引物对5。

其中，序列1由21个核苷酸组成；序列2由20个核苷酸组成；序列3由21个核苷酸组成；序列4由23个核苷酸组成；序列5由22个核苷酸组成；序列6由22个核苷酸组成；序列7由21个核苷酸组成；序列8由22个核苷酸组成；序列9由19个核苷酸组成；序列10由22个核苷酸组成。

在所述试剂盒中，组成每个引物对的两条单链DNA的摩尔数相等。

所述储粮扁谷盗可为如下中的至少一种：锈赤扁谷盗、长角扁谷盗、微扁谷盗、土耳其扁谷盗和开普扁谷盗。

在所述试剂盒中，所述引物对1特异于锈赤扁谷盗；所述引物对2特异于长角扁谷盗；所述引物对3特异于微扁谷盗；所述引物对4特异于土耳其扁谷盗；所述引物对5特异于开普扁谷盗。

本发明的再一个目的是提供所述试剂盒的制备方法。

所述试剂盒的制备方法，具体可包括如下步骤：将组成所述试剂盒中各引物对的各单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内：PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。

本发明的还一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定储粮扁谷盗的方法。

本发明所提供的鉴定或辅助鉴定储粮扁谷盗的方法，可为如下（a）-（e）中的任一种：

（a）鉴定或辅助鉴定待测储粮扁谷盗是否为锈赤扁谷盗的方法，包括如下（a1）和（a2）的步骤：

（a1）以所述待测储粮扁谷盗的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1和序列2所示的两条单链DNA组成的引物对1进行PCR扩增；

（a2）检测步骤（a1）得到的PCR产物的大小，按照如下方法根据PCR产物确定所述待测储粮扁谷盗是否为锈赤扁谷盗：若所述PCR产物中含有158bp的DNA片段，则所述待测储粮扁谷盗为或候选为锈赤扁谷盗；反之，则所述待测储粮扁谷盗不为或候选不为锈赤扁谷盗；

（b）鉴定或辅助鉴定待测储粮扁谷盗是否为长角扁谷盗的方法，包括如下（b1）和（b2）的步骤：

（b1）以所述待测储粮扁谷盗的基因组DNA为模板，用由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成的引物对2进行PCR扩增；