[发明专利]一种用LAMP-LFD芯片高通量检测微囊藻毒素的方法

说明书

技术领域

本发明属于自然水体毒素快速检测技术领域，具体涉及一种用LAMP-LFD芯片高通量检测微囊藻毒素的方法 

背景技术

微囊藻毒素(Microcystins)是一类具有生物活性的环七肽化合物，这类毒素主要由淡水铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)产生。此外其它种类的微囊藻，如绿色微囊藻(M.viridis)、惠氏微囊藻(M.wesenbergii)以及鱼腥藻(Anabaena)、念珠藻(Nostoc)、颤藻(Oscillatoria)的一些种或株系也能产生这类毒素。微囊藻毒素是自然水体蓝藻水华发生后最容易出现、产生量最大、造成危害最严重的蓝藻毒素，常引起人畜的急性肝中毒事故的发生。因此，研究快速、简便、灵敏的高通量微囊藻毒素快速检测方法实现对水体中微囊藻毒素的时时监控，对于保障自然水体尤其是饮用水体的安全性有着重要的意义。 

目前对于微囊藻毒素的检测方法也层出不穷，大多数实验室都采用细胞毒性实验法、化学分析法、ELISA及PPIA方法来检测微囊藻毒素。这些方法只能检测水体中己产生并累计到一定程度的微囊藻毒素，无法对微囊藻毒素的产生进行预判。同时由于细胞毒性实验涉及一系列伦理问题遭到越来越多人的抗议，而化学分析法所需要的分析仪器及标准品昂贵，且该方法对样品的前处理要求较高，且对检测环境由很高的要求，很难被广泛运用于基层的环境监测部门，实现毒素的现场分析检测。 

随着微囊藻毒素生物合成基因的发现，使得我们可以从毒素合成基因的角度入手，采用一种同以往毒素检测完全不同的思路对自然水体中微囊藻毒素的进行检测。即通过对水体中是否存在微囊藻毒素合成基因进行检测，间接的判断水体中是否存在微囊藻毒素，同时，由于基因从表达到转录再到翻译成可行使功能的蛋白质进而合成微囊藻毒素需要一定时间和过程。这也使得这种检测对于水体中微囊藻毒素的产生具有一定的超前性。将微囊藻毒素的检测从发生期前移到累积期，从而大大提高水体中微囊藻毒素的预防能力。 

环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification Method，LAMP)方法，最初由Notomi等人设计并应用于病原微生物的检测。该方法通过针对靶基因的6个区域而设计4种特异性引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下(60-65C)高效(0.5-1h)扩增目标DNA。该方法仅需要简单的水浴锅或者加热器，在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术。目前，国内外已有较多文献报道了该技术的应用，但是其大多数只应用于病原微生物检测方面，在微囊藻毒素检测方面的应用还未有先例。因此，该技术在微囊藻毒素检测中的运用必将给目前蓝藻毒素检测尤其是微囊藻毒素检测带来一场新的革命。 

横向流动试纸条(lateral flow dipstick，LFD)是一种新的对扩增产物的检测方法，反应中FITC标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，避免了琼脂糖凝胶电泳或荧光染料染色肉眼观察由非特异性扩增造成的假阳性，进一步提高了反应的特异性和灵敏度。LFD检测无需特殊的设备，操作者只需将产物和试纸条浸入缓冲液，并且不需EB等有毒试剂，操作简便且更安全。LAMP-LFD结合技术的检测结果可以直接肉眼观察。LFD试纸条上具有控制带和检测带，两条带均显色表示检测结果为阳性，只有控制带显色检测带不显色表明检测结果为阴性。LAMP-LFD结合方法安全、快捷、搞笑、高灵敏度且无设备及技术限制，具有其他技术无法替代的优势。 

发明内容

针对上述领域，本发明的目的是提供一种用LAMP-LFD芯片高通量检测微囊藻毒素的方法，以实现对微囊藻毒素基因进行快速、安全、特异、灵敏、简便的现场检测，克服已有用实验室都采用细胞毒性实验法、化学分析法、ELISA及PPIA方法来检测微囊藻毒素不能在现场应用的问题，从而弥补现有技术的不足。反应结果可以直接肉眼判定等优点适合各类试剂检测反应，特别适合现场以及野外的检测需要。 

本发明结合微囊藻毒素合成基因簇中，负责合成微囊藻毒素生物活性表达所必需的D-Glu 的mcyE基因的种间同源区域设计用于LMAP扩增的引物。并利用研发的LAMP-LFD芯片集成装置进行微囊藻毒素基因的检测，技术方案具体步骤如下：