[发明专利]一种用LAMP-LFD芯片高通量检测微囊藻毒素的方法

权利要求书

1.一种用LAMP-LFD芯片高通量检测微囊藻毒素的方法，其特征在于结合微囊藻毒素合成基因簇中，负责合成微囊藻毒素生物活性表达所必需的D-Glu的mcyE基因的种间同源区域设计用于LMAP扩增的引物。并利用研发的LAMP-LFD芯片集成装置进行微囊藻毒素基因的检测。 

2.一种用LAMP-LFD芯片高通量检测微囊藻毒素的方法的技术方案，其特征的具体步骤如下：设计LAMP的引物和探针：根据GeneBank中微囊藻毒素合成簇中的负责合成微囊藻毒素生物活性表达所必须的D-Glu的mcyE基因的己知序列(AAF00958、CCI17562、AA062582)，利用ClustalW比对软件寻找其保守区域，并按环介导等温扩增技术引物设计原则，针对mcyE基因的保守区域分别设计MCYE-F3、MCYE-B3、MCYE-FIP、MCYE-BIP、MCYE-LF、MCYE-LB一组共6条环介导等温扩增技术扩增特异引物和一条探针序列。 

3.引物信息详见下表： 

4.其中FIP为5’端BIPO生物素标记引物，FITC-Probe为5’端FITC标记探针：引物序列和控针序列分别与微囊藻生物合成mcyE基因上相应位置核苷酸序列相同或者互补。 

5.一种用LAMP-LFD芯片高通量检测微囊藻毒素的方法，其特征在于利用己制备高通量LAMP-LFD芯片系统。在高通量LAMP-LFD芯片检验检测系统通道的扩增池内中第1，2，3，4，5，6，7，8，9，10扩增池中包被上微囊藻毒素基因mcyE核酸LAMP引物组，特异性探针，第11扩增池中包被其他核酸探针第12扩增池中不包被核酸探针。在12个扩增池分别加入样品(10个样品核酸提取物，2个阴性对照样品)，在再加入LAMP反应液，反应体系的终浓度分别为：外引物F3和B3各0.2Umol/L，内引物FIP和BIP各1.6Umol/L，环引物LF和LB各0.4Umol/L，dNTPS0.96mmol/L，Tris-HCI(pH8.8)20mmol/L，KCI10mmol/L，Mg S0₄，6.5mmol/L，(NH4)SO₄10mmol/L，0.1％Triton x-100，8U Bst DNA聚合酶大片段(New EnglandBIPolabs)和1μL样品模板，加双蒸水使反应体系总体积为25μL。将高通量LAMP-LFD微囊藻毒素检测装置放置在恒温下进行LAMP反应应体系扩增，扩增反应温度为60℃，扩增反应时间为30min。反应结束后，通过导流槽将反应产物导入杂交池与5’端FITC标记的杂交探针进 行杂交，时间5min。 

6.LFD检测。其特征在于将LFD试剂条插入LFD卡槽里面，将杂交反应液导入LFD试纸条进行显色检测，判断横向侧析试纸条检测LAMP的结果。在包被有目标物探针的扩增池中反应物与LFD作用反应；LFD检测线上出现特征性反应带。而在阴性样品的扩增池对应的LFD没有出现反应带。