[发明专利]用于三聚氰胺残留免疫分析的人工抗原和抗体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于小分子化合物免疫化学和残留分析技术领域；涉及具有氨基苯环分子结构的三聚氰胺类小分子人工抗原的合成和免疫动物特异性抗体的制备。

背景技术

三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，因其含氮量高、白色无味、易于购买和生产，固有不法厂商针对凯氏定氮法的不足，将其添加于食品和饲料中以提高蛋白含量。虽然三聚氰胺属于低毒化合物，大鼠口服的半数致死量大于3g/kg体重，但美国FDA研究表明，三聚氰胺与钙在体内尿PH维持下形成不溶解的复合物，动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害、膀胱、肾部结石甚至进一步诱发膀胱癌。继三鹿奶粉事件后，国内又出现了多个品牌鸡蛋三聚氰胺检出超标，再一次引起消费者的担心。考虑到三聚氰胺可能通过一些非法的途径进入到饲料原料和产品中，因此，迫切需要建立一种快速准确、成本低、适合大规模推广的饲料和畜禽产品中三聚氰胺检测方法。

目前，三聚氰胺残留的常规检测方法包括色谱分析法，如高效液相色谱法、液相色谱/质谱法、液相色谱串联质谱法等，由于其设备昂贵操作繁琐而不适合大批量样品的检测；而基于抗原抗体免疫反应原理而建立的酶联免疫分析方法在大批量样品快速检测方面显示出巨大的优越性，操作简便，又具有相当的灵敏度，近年来在小分子有害化合物的免疫分析方法开发方面成为研究热点。该技术研究的关键是半抗原的分子设计合成和人工抗原及抗体的制备。因此，目标分析物分子免疫学特性，以及如何通过化学或生化技术突出和利用这些特性，是该领域重要的研究内容。这一技术目前已成为微量分析研究的一个崭新领域，可与传统分析方法并列作为一项新的分析途径。目前, 国内文献报道的三聚氰胺残留免疫检测试剂盒及试剂条均为国外进口, 价格昂贵。研制出具有自主知识产权的三聚氰胺免疫检测试剂非常必要。

发明内容

（需要解决的问题、技术方案、有益效果、具体实施方式）

需要解决的问题：针对现有检测技术中存在的不足之处，本发明的目的是通过合成具有氨基苯环结构的三聚氰胺人工抗原，制备针对三聚氰胺的特异性抗体；所制备的产品可用于食品中三聚氰胺含量的免疫检测，具有检测快速、操作简便、成本低的优点，为三聚氰胺免疫分析方法的建立及试剂盒的研制奠定基础。

技术方案：本发明选择4，6-二氨基-1，3，5-三嗪-2-乙酸为三聚氰胺半抗原，这样既保持了半抗原与三聚氰胺在结构上的相似性，又使半抗原分子具有了与载体蛋白连接的合适基团。该物质可通过直接购买获得，可免去三聚氰胺半抗原设计合成步骤，与载体蛋白偶联，制备有效的三聚氰胺免疫抗原和包被抗原，其反应方程式为：

用于三聚氰胺残留免疫分析的特异性人工抗体采用4，6-二氨基-1，3，5-三嗪-2-乙酸   与载体蛋白BSA偶联的免疫抗原，经动物免疫后取血，分离抗血清，纯化制得。

用于三聚氰胺药物残留分析的人工抗原和抗体的制备方法如下：

1、人工抗原的制备

三聚氰胺免疫抗原和包被抗原的合成

用三聚氰胺半抗原4，6-二氨基-1，3，5-三嗪-2-乙酸，通过活性酯法（NHS-DCC法）将半抗原与载体蛋白相偶联，制备三聚氰胺人工抗原和包被原，具体做法是：将41.5-42.5mg半抗原、33.5-34.5mg NHS、61.5-62.5mg DCC加入2mL的DMF，在4℃环境下搅拌过夜。次日将混合物离心，弃去沉淀，吸取上清液备用。将112.5-113.0mg BSA、74.5-75.0mg OVA分别溶于8mL 0.01mol/L，pH=7.4的PBS，将所得的上清液分成两份边搅拌边各自缓慢地加入上述两种溶液，4℃缓慢搅拌过夜。后将反应液转移至处理好的透析袋中，在PBS中彻底透析后收集，分装，-20℃保存。

 

2、三聚氰胺人工抗原的鉴定：采用紫外分光光度法测定偶联比。

采用紫外光谱法进行鉴定，载体蛋白和半抗原偶联后，产物会呈现与载体蛋白及半抗原都不相同的最大吸收峰。将半抗原、BSA、OVA及偶联物用PBS配成一定浓度，利用紫外分光光度计在200 ~ 400nm下分别对半抗原溶液、BSA溶液、OVA溶液及合成产物溶液进行紫外扫描。

3、抗体制备

免疫动物选用体重1.5公斤左右新西兰大白兔，采用背部皮内多点注射法免疫，初免后进行三次加强免疫，分别于初次免疫后2周、4周、6周免疫三次，此后间隔一个月加强免疫一次；

初次免疫时取2mg本发明的免疫抗原溶于2mL生理盐水与等量的弗氏完全佐剂充分混合乳化，进行动物免疫；