[发明专利]一种通过转化大豆毛状根鉴定抗蚜基因抗性功能的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养及转基因方法，具体涉及一种通过大豆毛状根来快速鉴定目的基因对大豆蚜虫是否有抗性的方法。

背景技术

大豆在我国栽培历史悠久，一直是一种重要的经济作物，但大豆在生长过程中面临诸多病虫害的侵扰，导致其产量和品质下降。其中，大豆蚜虫就是一种对大豆生长危害较大的害虫，导致大豆叶片光合速率降低、卷曲皱缩、植株矮化、结荚数减少，其携带的其他病毒（大豆花叶病毒、矮缩病等）更加剧了大豆产量的损失，所以急需从现有大豆种质资源中挖掘抗蚜基因。Kim等通过精细定位将Rag1锁定在约115kb的区间，将其中Glyma07g06890和Glyma07g06920确认为候选基因。2010年Kim又将PI200538中的Rag2定位在54kb的区间，经比对发现：一个编码F-box/LRR结构域的基因为唯一的候选基因（基因序列号为Glyma13g26000）。虽然目前国内外已在一些抗性材料上定位到多个抗蚜基因及位点（Rag1，rag1c，Rag2，Rag3，rag4，Rag5），但由于大豆遗传转化体系的不完善，所以通过转基因获得大豆再生苗的方法来验证抗蚜基因的功能仍比较困难，也导致这些抗蚜基因虽有的已经克隆（Rag1和Rag2），但还没有一例在大豆上经过确切的功能验证，其对大豆蚜虫的抗性效果到底如何仍有待试验支持，这也限制了这些基因在大豆抗性育种方面的应用，导致大豆抗蚜虫育种工作进展缓慢。因此，急需寻找一种更为便捷和可靠的方法来验证这些抗蚜基因的功能，从而筛选出抗性更强的基因资源，并明确各个抗蚜基因的抗虫谱，使大豆的抗蚜虫育种工作更有针对性。

Bais,H等研究认为发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）具有工业化生产所需求的特点，如无需添加外源生长素、迅速自主生长、遗传稳定性高、能合成植物特有的次生代谢物而且其含量往往比植物的含量还高。Qu等在研究马铃薯粉痂病病源生物寄生特性时，首次使用由农杆菌诱导的马铃薯毛状根器官离体接种病源微生物粉痂菌，通过显微观察来了解粉痂菌生长发育的不同时期各种寄生结构与特性的变化。文献介绍，大豆蚜虫具有专化性，越冬在鼠李属的几种植物根部；大豆蚜虫抗性的鉴定和蚜虫的繁殖都是在完整植株上，完整植株繁殖蚜虫有不易控制等缺点。如何鉴定大豆抗蚜基因的抗性功能，是生物技术领域急需解决的问题。

发明内容

本发明针对现有技术存在的缺点和不足，提供一种通过转化大豆毛状根鉴定抗蚜基因抗性功能的方法，在大豆上快速鉴定抗蚜基因功能。本发明实施简单方便，利用本发明可以便捷和可靠鉴定抗蚜虫基因的抗性功能及抗虫谱。

本发明提供的抗蚜性鉴定方法包括将大豆蚜虫接种在根癌农杆菌诱导的大豆毛状根上，观察和统计蚜虫的生长情况，以蚜虫的平均相对生长速率和平均相对繁殖速率作为抗蚜基因对大豆蚜虫抗性能力的鉴定依据。所述抗性鉴定方法包括如下步骤：

1）获得大豆子叶；

2）侵染转化诱导毛状根；

3）除菌并继续培养；

4）毛状根接蚜；

5）抗蚜功能鉴定。

优选地，在第1）步中，获得大豆子叶的方法为：挑选健康无病斑的成熟感蚜虫大豆籽粒，清水漂洗干净，体积分数75%酒精消毒30～60秒，质量体积分数0.1%的Ca(ClO)₂消毒20～30分钟，期间摇晃5～7次左右，无菌水洗去Ca(ClO)₂残留，冲洗5～8次，接种在萌发培养基中，无菌萌发5～7天后得所述大豆子叶。更优选地，萌发培养条件为：光照16h/天，25±3℃；更优选地，萌发培养基的成分为：MSB+7g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH值为5.8。

优选地，在第2）步中，诱导毛状根的方法为，采用发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）K599菌株诱导大豆子叶产生毛状根。优选地，诱导毛状根的方法具体操作方法为：用无菌的手术刀片将子叶从下胚轴切下，在子叶近胚轴3mm，远轴心面切半径约4mm的伤口，伤口深至中轴（但不能穿破子叶）。将切好的子叶放在内附滤纸的培养皿中，并滴加1/4MSB5液体培养基（使滤纸完全湿润但无剩余），在子叶的伤口处滴加20μL准备好的发根农杆菌箘液，封口膜封住培养皿，暗培养3～5天后恢复光照培养，光照16h/天，25±3℃，培养1～2周，伤口处开始出现愈伤，接着有毛状根产生。