[发明专利]快速鉴定工艺葫芦种子真实性和/或品种纯度的方法

说明书

技术领域

本发明涉及种子纯度的鉴别，特别是一种鉴定工艺葫芦种子真实性/或品种纯度的方法。 

背景技术   

葫芦（学名：Lagenaria siceraria）是属于葫芦科葫芦属的一种爬藤植物，其果实也被称为葫芦。葫芦的果实在未成熟时可作为蔬菜食用，成熟后可加工成工艺品。因为工艺葫芦具有多变的造型和精湛工艺，日益受到人们的钟爱。近年来工艺葫芦种植，加工销售已经成为山东聊城市的一大支柱产业。工艺葫芦种类繁多，包括：大亚腰葫芦、小亚腰葫芦、细长柄锤形葫芦、粗长柄锤形葫芦、冬瓜葫芦、疙瘩葫芦、棒子葫芦、大瓢葫芦、小瓢葫芦、鹤首葫芦、三挺葫芦、鸡蛋葫芦、美国小手捻葫芦、苹果葫芦、小南瓜葫芦、新疆特大亚腰葫芦、本长葫芦、异形葫芦、中号葫芦等几十个品种。不同品种有不同的制作工艺和商业价值。

由于目前工艺葫芦种子的真实性/或品种纯度尚无确定的鉴定方法，在葫芦的生产与销售过程中，多因种子纯度不够而招致收入损失的情况发生；如何保护工艺葫芦种质资源也是急需解决的问题；开展工艺葫芦遗传改良也屡屡遇到困境。 

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种通过种子蛋白质SDS—PAGE电泳方法鉴定工艺葫芦种子真实性/或品种纯度的方法。 

本发明的技术方案是： 

鉴定工艺葫芦种子真实性和/或品种纯度的方法，以工艺葫芦的种子为材料，经单粒机械粉碎，加入蛋白质提取液，将所得到的蛋白质进行SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳对比分析，得到每粒待检测种子的电泳图谱，将每粒待检测种子的电泳图谱与标准种子的电泳图谱进行比较，得出待检测种子的真实性和/或品种纯度。

前面所述的方法，优选的方案在于：具体包括下列步骤： 

A）挑取1粒饱满的种子去壳称重，将种子粉碎至粉末状，加入3-5倍体积(g／mI)的预冷的盐溶蛋白提取液和聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP)0.002g，混匀后4℃下冰上静置3 -4 h，4 ℃，12 000 r/min ^－ 1 离心20min，取其上清液4℃保存备用；

B）配制种子蛋白电泳胶板：采用SDS—PAGE，其中，分离胶工作液浓度为10％，浓缩胶工作液浓度为2.5％；

C）单向垂直板电泳灌胶：灌好分离胶后，马上用枪沿玻璃板均匀地加入双蒸水以压平胶面，待分离胶凝固后，将双蒸水吸出，灌入浓缩胶，插入梳子，待浓缩胶凝固后拔掉梳子，移去胶板周围的胶条，将胶板旋转方向水平旋转，低玻璃槽朝内，放人电泳槽，加入电极缓冲液，内侧液面要没过内层玻璃，准备点样；

D）电泳:样品上样量20ul，与等量的上样缓冲液混合上样。电泳槽电极接上电源后，把电压调到200伏特，待前沿指示剂跑到浓缩胶和分离胶的分界线时，将电压调到150伏特。前沿指示剂到底后再延长30 min，停止电泳；

E）染色:去掉浓缩胶，在分离胶的左上角切去一个小角(以作记号，易辨点样顺序)，把胶板剥入盛有染色液的培养皿中，染色过夜（12-14h）；

F）脱色:取出胶板放人盛有脱色液的培养皿中脱色，每5～6 h更换一次脱色液，直至胶板底色褪去，蛋白谱带清晰可见；

G）将每粒待检测种子的电泳图谱与按照所述步骤A)-F)的方法得到的标准种子的电泳图谱进行比较，得出待检测种子的真实性和/或品种纯度。

前面所述的方法，优选的方案在于：步骤A）所述盐溶蛋白提取液的制备：准确称取2.922g NaC1固体溶于80 ml双蒸水中，后加蒸馏水至100ml。 

前面所述的方法，优选的方案在于：步骤B）所述分离胶工作液的制备方法是：配制40ml的分离胶工作液需加入：13.3ml的30%丙烯酰胺（Acr）+0.8%N，N’—甲叉双丙烯酰胺（Bis）混合溶液、10ml 1.5mTris（PH8.8)、0.4ml 10%SDS溶液、13.3ml蒸馏水、加3ml的1.5%过硫酸铵(AP)溶液。 

前面所述的方法，优选的方案在于：所用30％丙烯酰胺储液（Acr）+0.8%N，N’—甲叉双丙烯酰胺（Bis）混合溶液的制备：准确称取73.00g丙烯酰胺和2.00g N，N’-甲叉丙烯酰胺，各自溶解后，混合溶于200 ml双蒸水中，并用双蒸水定容到250 ml，滤纸过滤，4℃下于棕色瓶中避光保存备用。