[发明专利]快速鉴定工艺葫芦种子真实性和/或品种纯度的方法

权利要求书

1.快速鉴定工艺葫芦种子真实性和/或品种纯度的方法，其特征在于：以工艺葫芦的种子为材料，经单粒机械粉碎，加入蛋白质提取液，将所得到的蛋白质进行SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳对比分析，得到每粒待检测种子的电泳图谱，将每粒待检测种子的电泳图谱与标准种子的电泳图谱进行比较，得出待检测种子的真实性和/或品种纯度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：具体包括下列步骤：

A）挑取1粒饱满的种子去壳称重，将种子粉碎至粉末状，加入3-5倍体积(g／mI)的预冷的盐溶蛋白提取液和聚乙烯吡咯烷酮K30 （PVP)0.002g，混匀后4℃下冰上静置3 -4 h，4 ℃，12 000 r/min ^－ 1 离心20min，取其上清液4℃保存备用；

B）配制种子蛋白电泳胶板：采用SDS—PAGE，其中，分离胶工作液浓度为10％，浓缩胶工作液浓度为2.5％；

C）单向垂直板电泳灌胶：灌好分离胶后，马上用枪沿玻璃板均匀地加入双蒸水以压平胶面，待分离胶凝固后，将双蒸水吸出，灌入浓缩胶，插入梳子，待浓缩胶凝固后拔掉梳子，移去胶板周围的胶条，将胶板旋转方向水平旋转，低玻璃槽朝内，放人电泳槽，加入电极缓冲液，内侧液面要没过内层玻璃，准备点样；

D）电泳:样品上样量20ul，与等量的上样缓冲液混合上样，电泳槽电极接上电源后，把电压调到200伏特，待前沿指示剂跑到浓缩胶和分离胶的分界线时，将电压调到150伏特，前沿指示剂到底后再延长30 min，停止电泳；

E）染色:去掉浓缩胶，在分离胶的左上角切去一个小角(以作记号，易辨点样顺序)，把胶板剥入盛有染色液的培养皿中，染色过夜（12-14h）；

F）脱色:取出胶板放人盛有脱色液的培养皿中脱色，每5～6 h更换一次脱色液，直至胶板底色褪去，蛋白谱带清晰可见；

G）将每粒待检测种子的电泳图谱与按照所述步骤A)-F)的方法得到的标准种子的电泳图谱进行比较，得出待检测种子的真实性和/或品种纯度。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤A）所述盐溶蛋白提取液的制备：准确称取2.922g NaC1固体溶于80 ml双蒸水中，后加蒸馏水至100ml。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤B）所述分离胶工作液的制备方法是：配制40ml的分离胶工作液需加入：13.3ml的30%丙烯酰胺（Acr）+0.8%N，N’—甲叉双丙烯酰胺（Bis）混合溶液、10ml 1.5mTris（PH8.8)、0.4ml 10%SDS溶液、13.3ml蒸馏水、加3ml的1.5%过硫酸铵(AP)溶液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所用30％丙烯酰胺储液（Acr）+0.8%N，N’—甲叉双丙烯酰胺（Bis）混合溶液的制备：准确称取73.00g丙烯酰胺和2.00g N，N’-甲叉丙烯酰胺，各自溶解后，混合溶于200 ml双蒸水中，并用双蒸水定容到250 ml，滤纸过滤，4℃下于棕色瓶中避光保存备用。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所用1.5mol/LTris-HCL（PH值8.8)的制备：准确称量18.17gTris溶于80ml双蒸水，加入0.23ml的四甲基乙二胺( TEMED)，并用双蒸水定容到100ml，再用的10mol/L的盐酸调PH值到8.8，于4℃保存备用。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤B）所述浓缩胶工作液的制备方法是：配制10ml的分离胶工作液需加入：1.25ml30%丙烯酰胺（Acr）+0.8%N，N’—甲叉双丙烯酰胺（Bis）混合溶液、2.5ml 0.5MTris-HCL（PH6.8)、0.1ml 10%SDS溶液、5.65ml的蒸馏水、再加0.5ml的1.5%过硫酸铵(AP)溶液。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所用0.5mol/LTris-HCL（PH6.8)的制备：准确称量Tris 6.07g溶于双蒸水中，加入0.46ml的四甲基乙二胺( TEMED)，并用双蒸水定容到100 ml，再用3 mol/L的盐酸调pH值到6.8，于4℃保存备用。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所用10％SDS溶液的制备：准确称取10.0 g SDS溶于80 ml双蒸水中，加热促溶，不断搅拌，直至溶液澄清，加双蒸水定容到100 ml，避光保存备用。