[发明专利]固相合成胰高血糖素

说明书

技术领域

本发明涉及医药多肽类原料药的化学合成，尤其涉及一种高温下固相合成胰高血糖素。

背景技术

胰高血糖素（glucagon）亦称胰增血糖素或抗胰岛素或胰岛素B。是一种由胰脏胰岛α-细胞分泌的激素，由29个氨基酸组成直链多肽，分子量为3485道尔顿。与胰岛素相对抗，起着增加血糖的作用。于1953年，被分离沉淀而取得结晶。

目前制备胰高血糖素的方法有DNA重组和化学固相合成法。00112488.9公开了一种胰高血糖素的制备工艺，采用废弃的胰岛素钠盐结晶母液为原料，用Zn++沉淀或稀释母液，调pH值上阳离子交换凝胶柱的方法制取胰高血糖素，优点是变废为宝，提高综合经济效益。CN1225126A涉及在基因改造酵母细胞中生产胰高血糖素的一种新方法。

胰高血糖素（glucagon）是一种比较难合成的29肽，目前合成方法都在常温下进行（10-30℃），一个氨基酸的脱保护过程至少需要30分钟，缩合反应需要至少2小时，且多个氨基酸需要重复投料或封端处理，耗时长，产率却低，方法成本高。在高温下进行固相多肽自1989年以来就有报道，但迄今为止报道的篇幅十分有限，且研究也局限在手性杂质或消旋副反应的影响上。商业上推广应用基本没有。伪脯氨酸工艺是比较新颖的Fmoc固相合成方法，可有效减少肽的聚合，降低长肽或困难肽的合成难度。高温法合成胰高血糖素（glucagon）的方法还未见报道。

因此，本领域迫切需要提供一种既能缩短反应时间，同时又能避免副反应发生、产率较高的固相合成胰高血糖素的方法。

发明内容

本发明旨在提供一种胰高血糖素的固相合成方法。

在本发明的第一方面，提供了一种胰高血糖素的固相合成方法，所述方法包括步骤：

以固相合成树脂为起始原料，采用Fmoc/t-Bu固相合成策略依次连接保护氨基酸或多肽，得多肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，所述多肽合成温度不限于常温下进行，所述Fmoc保护氨基酸为Fmoc保护氨基酸单体或Fmoc保护二肽。

在另一优选例中，所述方法中2-28#胰高血糖素合成在35-80℃下进行。

在另一优选例中，所述方法中2-28#胰高血糖素合成在50-80℃下进行。

在另一优选例中，所述方法中2-28#胰高血糖素合成在60-80℃下进行。

在另一优选例中，所述方法中2-28#胰高血糖素合成在35-59℃和在61-85℃下进行。

在另一优选例中，所述方法中1#胰高血糖素合成在常温下进行；更佳地，1#胰高血糖素合成在15-25℃下进行。

在另一优选例中，可采用伪脯氨酸保护二肽进行氨基酸缩合反应；所述伪脯氨酸二肽可以是Fmoc-Gly-Thr(ψ^Me,Me Pro),Fmoc-Thr(tBu)-Ser(ψ^Me,MePro),Fmoc-Tyr(tBu)-Ser(ψ^Me,MePro),Fmoc-Asp(OtBu)-Ser(ψ^Me,Me Pro)中的一种或多种。

在另一优选例中，脱去一个Fmoc-保护基团的时间为20秒-4分钟。

在另一优选例中，连续两次脱去Fmoc-保护基团，一次进行20-40秒，一次2-4分钟。

在另一优选例中，所述接肽反应时间为每次5-25分钟。

在另一优选例中，依次连接具有Fmoc保护基团的氨基酸，获得保护的二十九肽树脂，依次包括如下步骤：

(a)装载Fmoc-Thr(tBu)-Wang树脂；

(b)在35-80℃下，用含有DMF的溶液连续两次进行脱保护处理，然后树脂用DMF洗涤；

(c)在35-80℃下在DMF中使用DIC/HOBt进行接肽反应，然后再加入脱保护剂处理，再加入具有Fmoc保护基团的氨基酸，如此重复，获得多肽树脂。

据此，本发明提供了一种既能缩短反应时间，同时又能避免副反应发生、产率较高的固相合成胰高血糖素的方法。

附图说明

图1是实施例1的HPLC图谱。

图2是实施例1的质谱图。

图3是实施例3和固相常温反应分别所获得的胰高血糖素粗品的HPLC检测图谱；

其中A是实施例3的图谱，B是图形常温反应得到的粗肽的图谱。

具体实施方式