[发明专利]真菌固态发酵生产脱落酸的方法

说明书

技术领域

 本发明涉及一种脱落酸的生产方法，特别是一种真菌固态发酵生产脱落酸的方法。背景技术

 脱落酸（Abscisic Acid,缩写为ABA)是植物五大天然生长调节剂之一。单纯的天然活性脱落酸（+)-ABA的生产成本极高。由于昂贵的价格和活性上的差异，脱落酸一直未被广泛应用于农业生产当中。

现有的脱落酸生产方法包括：（1）植物提取法（2）化学合成法（3）真菌液态发酵法。

植物提取法是脱落酸发现早期所使用的提纯方法。通过富集、浓缩、萃取等一系列步骤提取植物中的脱落酸。由于植物中本身含有的脱落酸极其稀少，导致该方法无法应用到工业生产当中。

脱落酸存在两种光学构型：（+）-ABA、（-）-ABA。现有植物中只存在（+）-ABA，而且只有（+）-ABA才具有生理学活性。通过化学合成法生产的脱落酸包含两种光学构型，为外消旋脱落酸。与单纯的天然脱落酸相比，活性低1/3-1/2。

真菌液态发酵法是现阶段流行的天然脱落酸生产方法。该方法采用灰葡萄孢霉菌进行液态发酵生产。灰葡萄孢霉菌是丝状真菌，其天然生长环境并非液态培养形式。因此，液态发酵法并不能发挥该系列真菌的最高发酵能力。其次，液态发酵法存在投资巨大、易染菌、成本偏高、外排废液污染等问题，这不利于整个脱落酸生产产业的发展和应用。特别是外排高浓度有机废液，不仅会造成企业承受很大的环保压力，更重要的是对生态环境造成破坏。

发明内容

本发明的目的在于提供一种真菌固态发酵生产脱落酸的方法。本发明通过固态发酵法生产天然脱落酸，与液态发酵法相比，具有发酵水平高、投资小、染菌率低、无有机废液等优点。除此之外，利用该方法生产天然脱落酸，在提纯工艺上极为简单，可以通过常规的有机物提取方法，即可得到超高纯度的天然脱落酸结晶。这在很大程度上，可以推进整个天然脱落酸产业的工业化和其在农业生产上的应用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种真菌固态发酵生产脱落酸的方法，具体步骤如下：

（1）菌种制备

     筛选正诱变的灰葡萄孢霉菌为生产菌种，再通过活化和扩大培养，形成平皿固态菌种，备用；

    （2）发酵培养基制备

发酵培养基按照重量百分比的原料为：小米15-25%、大米15-25%、葡萄糖0.1-2%、蔗糖0.1-4%、蛋白胨1-4%、CaCO₃ 0.5-1.5%、Na₂HPO₄·12H₂O 0.1-0.5%、Ca(HO)₂  0.5-1.5%、MgSO₄  0.01-0.05%、提纯残留物0.5-1%，其他成份为水；其中，提纯残留物是指发酵产物提取过程中分离浓缩得到的非脱落酸物质；

发酵培养基的制作方法：将所有原料混合，加水拌匀，置于蒸饭柜中进行预热处理；将预热好的培养基打散，称量分装到培养浅盘中，每盘装取400-800g培养基；将培养浅盘置于灭菌柜中，进行高压灭菌，备用；

（3）生产接种

将步骤（1）制备的平皿固态菌种碾碎，均匀分散到步骤（2）灭菌后的培养浅盘当中；每个培养浅盘使用2-4个平皿菌种；接种重量为培养基的6-10%；

（4）发酵培养

将已接种的培养浅盘移入发酵间，置于发酵培养装置中进行培养；培养模式如下：

培养0-48小时的平均温度为26.5-28.5℃、平均通气量为5-10L/100盘/天；

培养48-96小时的平均温度为26-28℃、平均通气量为15-20L/100盘/天；

培养96-216小时的平均温度为22-24.5℃、平均通气量为40-50L/100盘/天；

培养216-288小时的平均温度为25.5-26.5℃、平均通气量为10-20L/100盘/天；

（5）天然脱落酸提纯：对步骤（4）的发酵产物进行提纯即得天然脱落酸。

作为本发明进一步的方案：步骤（1）中通过天然筛选、紫外诱变、硫酸二乙酯诱变、YAG倍频脉冲激光照射以及生产中动态筛选获得正诱变的灰葡萄孢霉菌。

作为本发明再进一步的方案：所述生产中动态筛选的具体步骤如下：

1）菌种采集：在日常生产过程中，每批次随机选择10-50盘无污染、长势优良的发酵浅盘；从发酵浅盘中挑取菌种，置于PDA平皿中，26-30℃静止培养5-7天，制成待测试菌种；