[发明专利]真菌固态发酵生产脱落酸的方法

权利要求书

1.一种真菌固态发酵生产脱落酸的方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)菌种制备

筛选正诱变的灰葡萄孢霉菌为生产菌种，再通过活化和扩大培养，形成平皿固态菌种，备用；

(2)发酵培养基制备

发酵培养基按照重量百分比的原料为：小米15-25%、大米15-25%、葡萄糖0.1-2%、蔗糖0.1-4%、蛋白胨1-4%、CaCO₃ 0.5-1.5%、Na₂HPO₄·12H₂O 0.1-0.5%、Ca(HO)₂  0.5-1.5%、MgSO₄  0.01-0.05%、提纯残留物0.5-1%，其他成份为水；其中，提纯残留物是指发酵产物提取过程中分离浓缩得到的非脱落酸物质；

发酵培养基的制作方法：将所有原料混合，加水拌匀，置于蒸饭柜中进行预热处理；将预热好的培养基打散，称量分装到培养浅盘中，每盘装取400-800g培养基；将培养浅盘置于灭菌柜中，进行高压灭菌，备用；

(3)生产接种

将步骤（1）制备的平皿固态菌种碾碎，均匀分散到步骤（2）灭菌后的培养浅盘当中；每个培养浅盘使用2-4个平皿菌种；接种重量为培养基的6-10%；

(4)发酵培养

将已接种的培养浅盘移入发酵间，置于发酵培养装置中进行培养；培养模式如下：

培养0-48小时的平均温度为26.5-28.5℃、平均通气量为5-10L/100盘/天；

培养48-96小时的平均温度为26-28℃、平均通气量为15-20L/100盘/天；

培养96-216小时的平均温度为22-24.5℃、平均通气量为40-50L/100盘/天；

培养216-288小时的平均温度为25.5-26.5℃、平均通气量为10-20L/100盘/天；

(5)天然脱落酸提纯：对步骤（4）的发酵产物进行提纯即得天然脱落酸。

2.根据权利要求1所述的真菌固态发酵生产脱落酸的方法，其特征在于，步骤（1）中通过天然筛选、紫外诱变、硫酸二乙酯诱变、YAG倍频脉冲激光照射以及生产中动态筛选获得正诱变的灰葡萄孢霉菌。

3.根据权利要求2所述的真菌固态发酵生产脱落酸的方法，其特征在于，所述生产中动态筛选的具体步骤如下：

菌种采集：在日常生产过程中，每批次随机选择10-50盘无污染、长势优良的发酵浅盘；从发酵浅盘中挑取菌种，置于PDA平皿中，26-30℃静止培养5-7天，制成待测试菌种；

发酵培养：将菌种接种于含培养基的发酵浅盘当中进行培养；培养条件与日常生产保持一致；

突变菌株检测：对发酵物中的脱落酸含量进行检测，测得待测试菌种的发酵率；若待测试菌种的发酵率无明显变化，则将其舍弃，对应的发酵产物并入日常生产，提取其中脱落酸；若出现正变株，则对其进行稳定性测试；

正变株稳定性测试：从正变株中挑出3-8株，并测定其传代3-8代的菌种发酵率；发酵培养条件与日常生产保持一致；若菌种在3-8代内未出现明显衰退，则视其通过稳定性测试；

正变株投入使用：将通过稳定性测试的正变株投入到生产使用中，并继续以上动态筛选步骤。

4.根据权利要求1所述的真菌固态发酵生产脱落酸的方法，其特征在于，步骤（1）中通过培养基A对灰葡萄孢霉菌进行活化培养，所述培养基A按照重量百分比的原料为：土豆10-20%、琼脂1-3%、葡萄糖0.1-1%、乳糖0.1-0.5%、蔗糖1-2%、Ca(NO3)2·4H2O 0.01-0.05%、蛋白胨1-2%、Na2HPO4·12H2O 0.1-0.5%，其他成份为水。

5.根据权利要求1所述的真菌固态发酵生产脱落酸的方法，其特征在于，步骤（1）中通过培养基B对活化的葡萄孢霉菌进行扩大培养，培养基B用于固态接种；所述培养基B按照重量百分比的原料为：小米5-10%、大米5-10%、葡萄糖0.1-1%、蔗糖1-2%、蛋白胨1-2%、Ca(NO₃)₂·4H₂O 0.01-0.05%、Na₂HPO₄·12H₂O 0.1-0.5%、琼脂1-3%，其他成份为水；所述小米、大米需蒸煮、过滤取汁。