[发明专利]双重分子信标-LAMP法同时检测金黄色葡萄球菌基因和大肠杆菌基因的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，涉及一种双重分子信标-环介导等温扩增技术同时检测两种食源性致病菌的方法，具体涉及双重分子信标-LAMP法同时检测金黄色葡萄球菌基因nuc和大肠杆菌O157:H7的rfbE基因的试剂盒及方法。 

背景技术

民以食为天，食以安为先。食品安全问题已经成为困扰全世界的一个重大的安全隐患问题，特别是病原微生物所致的食品污染及食源性疾病已成为一个世界性公共卫生问题。世界卫生组织(WHO)报告称全世界每年发生的食源性疾病数十亿例，发达国家每年至少有三分之一的人群患食源性疾病，其中约有170万15岁以下儿童因食源性微生物污染引起腹泻而死亡。微生物性食物中毒事件中常见的重要致病菌为：金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌和沙门氏菌、肉毒梭菌、李斯特单核细胞增生菌、假单细胞菌和大肠杆菌O157：H7等。 

目前我国食品卫生监督检验部门对食源性疾病的病原检测、鉴定手段仍停留在传统的病原菌培养、血清抗体检测和生化特征比较水平，检测时间一般为2-4天之间，有些甚至达到7天，而且生化实验和血清学实验不稳定，检测灵敏度较低，另外，当前的检测手段一般只能检测一种病原微生物，而大部分情况下，食品的污染都不是单菌感染，从而增加了鉴定的工作量，减低了检测效率。 

随着分子生物学技术的发展，人们采用PCR技术应用于细菌的诊断。例如中国专利公开号为CN1526825的专利申请中提到一种通过DNA提取、PCR扩增、电泳及凝胶成像观察等手段检测副溶血弧菌的 方法。然而PCR技术容易受到污染，此外其需要特殊的仪器和设备，对操作人员的技术要求高，因而限制了其广泛的应用。 

环介导等温扩增（LAMP）技术是2000年日本Notomi T等人开发出来的一种新的核酸扩增方法，可以把浑浊度作为鉴定指标，只要用肉眼观察白色混浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察等过程，易于在一些基层机构推广和应用，有着极为广泛的应用前景。LAMP技术被广泛的应用于检测食品中EcoliO157：H7、金黄色葡萄球菌、阪崎肠杆菌、副溶血性弧菌、粪肠球菌、志贺氏菌、假结核耶尔森氏菌、迟钝华氏菌(E．tarda)、沙门氏菌等许多细菌的检测，结果均显示出了该方法的高特异、高灵敏度。但是，LAMP产物易受气溶胶污染，造成假阳性结果。 

分子信标技术是1996年Tyagi和Kramer首先提出的一种基于核酸碱基配对原则和荧光共振能量原理设计的具有颈环构型的分子探针，在PCR扩增的退火阶段，分子信标与生成的靶序列结合发出荧光，在延伸阶段，脱离靶序列而不干扰扩增，随着循环次数的增加，与模板结合的分子信标的量亦增加，最终的荧光强度与扩增的模板量成正比。该技术具有极高的特异性，而且操作简便、灵敏度高，特别是它可以进行实时定量检测、甚至可以用于活体分析。 

由于生态环境的变化和抗生素的滥用，很多致病菌所引起的临床症状越来越不典型，常常需要同时检测多种细菌才能确定致病原，因此，亟需建立一种能够快速、高特异性和灵敏性、同时检测多种病原微生物的诊断技术。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种双重分子信标-LAMP法同时检测金黄色葡萄球菌基因nuc和大肠杆菌O157:H7的rfbE基因的试剂盒及方法， 能够快速、有效的检测出金黄色葡萄球菌基因nuc和大肠杆菌O157:H7的rfbE基因两种食源性致病菌。 

双重分子信标-LAMP法同时检测金黄色葡萄球菌基因nuc和大肠杆菌O157:H7的rfbE基因的试剂盒，包括LAMP反应体系，所述LAMP反应体系中含有检测金黄色葡萄球菌基因nuc和大肠杆菌O157：H7的rfbE基因的引物组，该引物组包含nuc基因的一对外引物F3、B3，一对内引物FIP、BIP和一个分子信标探针；还包含rfbE基因的一对外引物F3、B3，一对内引物FIP、BIP和一个分子信标探针； 

其中，所述的nuc基因的引物组为： 

外引物F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示； 

外引物B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示； 

内引物FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示； 

内引物BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示； 

分子信标探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示； 

所述的rfbE基因的引物组为： 

外引物F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示； 

外引物B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示；