[发明专利]双重分子信标-LAMP法同时检测金黄色葡萄球菌基因和大肠杆菌基因的试剂盒及方法

权利要求书

1.双重分子信标-LAMP法同时检测金黄色葡萄球菌基因nuc和大肠杆菌O157:H7的rfbE基因的试剂盒，其特征在于，包括LAMP反应体系，所述LAMP反应体系中含有检测金黄色葡萄球菌基因nuc和大肠杆菌O157：H7的rfbE基因的引物组，该引物组包含nuc基因的一对外引物F3、B3，一对内引物FIP、BIP和一个分子信标探针；还包含rfbE基因的一对外引物F3、B3，一对内引物FIP、BIP和一个分子信标探针；

其中，所述的nuc基因的引物组为：

外引物F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；

外引物B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；

内引物FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；

内引物BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；

分子信标探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示；

所述的rfbE基因的引物组为：

外引物F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；

外引物B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示；

内引物FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示；

内引物BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示；

分子信标探针的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.10所示；

所述的LAMP反应体系的总体积为25μl，包括以下组分：

1）2μl的待测样品模板DNA；

2）nuc基因和rfbE基因的外引物F3、B3各0.4μM/L，内引物FIP、BIP各2.4μM/L，rfbE基因的外引物F3、B3各0.4μM/L，内引物FIP、BIP各2.4μM/L；

3）DNA聚合酶：每μl含8个活性单位的Bst DNA聚合酶；

4）2.8mmol/l的dNTP，0.8mol/l的甜菜碱，2μl的Buffer，2μl的ddH₂O。

2.根据权利要求1所述的双重分子信标-LAMP法同时检测金黄色葡萄球菌基因nuc和大肠杆菌O157:H7的rfbE基因的试剂盒，其特征在于，所述的Nuc基因的分子信标探针的核苷酸序列的5’端连接有荧光染料Rox，3’端连接有荧光猝灭基团DABCYL。

3.根据权利要求1所述的双重分子信标-LAMP法同时检测金黄色葡萄球菌基因nuc和大肠杆菌O157:H7的rfbE基因的试剂盒，其特征在于，所述的rfbE基因的分子信标探针的核苷酸序列的5’端连接有荧光染料FAM，3’端连接有荧光猝灭基团DABCYL。

4.采用权利要求1所述的双重分子信标-LAMP法同时检测金黄色葡萄球菌基因nuc和大肠杆菌O157:H7的rfbE基因的试剂盒进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）采用LAMP反应体系，该体反应体系包括金黄色葡萄球菌基因nuc的引物和分子信标探针，大肠杆菌O157:H7的rfbE基因的引物和分子信标探针；

2）待测样品处理及模板提取

取待测细菌样品，用生理盐水悬浮后，离心，取沉淀，向沉淀中加入样品预处理液，混合均匀后，煮沸10min后，冷却10min，再次离心，取上清，得到待测样品的模板DNA；

3）LAMP等温扩增

将待测样品的模板DNA加入到LAMP反应体系中，在60～70℃下，反应50～70min；

4）显色检测

取LAMP等温扩增后的产物，加入显色液，与阳性对照，直接以肉眼观察变化。

5.根据权利要求4所述的双重分子信标-LAMP法同时检测金黄色葡萄球菌基因nuc和大肠杆菌O157:H7的rfbE基因的检测方法，其特征在于：步骤2）所述的样品预处理液是将40μl20mg/mL的溶菌酶，30μl10%的SDS，10μl20mg/mL的蛋白酶K和100μl5mol/L的NaCl，充分混匀后，在8000r/min下，离心10min后，得到的上清液。

6.根据权利要求5所述的双重分子信标-LAMP法同时检测金黄色葡萄球菌基因nuc和大肠杆菌O157:H7的rfbE基因的检测方法，其特征在于：所述的溶菌酶在使用前先在37℃下，保温30min；所述的蛋白酶K在使用前先在53℃下，保温30min。

7.根据权利要求4所述的双重分子信标-LAMP法同时检测金黄色葡萄球菌基因nuc和大肠杆菌O157:H7的rfbE基因的检测方法，其特征在于：步骤2）所述的离心是在8000～12000r/min下，离心1～3min。