[发明专利]一种对金银花不定芽转化获得转基因植株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种对金银花不定芽转化获得转基因植株的方法，属于植物基因工程领域。 

背景技术

金银花(Lonicera japonica L.)是忍冬科忍冬属的多年生半常绿缠绕木质藤本植物，自古被誉为清热解毒的良药。具有抗菌抗病毒、解热、升高白细胞、保肝利胆、免疫调节、抗肿瘤、降血压、降血脂、清除自由基等功能。金银花的主要化学成分有黄酮类、有机酸类、三萜皂苷类、挥发油等，其中绿原酸(Chlorogenic acid)为主要功能性成分，其含量高低是评价药材质量的重要指标。金银花的用途广、用量巨大，伴随其不断的开发新用途，用量不断增加，是家喻户晓的保健和去火饮品，目前金银花的年需要量在万吨之上。但长期以来，产量低、质量不稳定、产值低成为限制生产发展的关键因素。在金银花需求量猛增的新形势下，通过植物遗传技术来提高药材产量，稳定药材质量，增加种植收益具有重要的意义。 

农杆菌是一类革兰氏阴性菌，包括根癌农杆菌（含有致瘤Ti质粒）和发根农杆菌（含致根Ri质粒），金银花的遗传转化主要使用根癌农杆菌。根癌农杆菌的Ti质粒含有T-DNA区，T-DNA可将携带的任何基因整合到植物基因组中，实现外源基因的导入。 

根癌农杆菌介导的转化过程包括：细菌在敏感细胞上吸附，植物伤口处产生酚类物质或外源添加酚类物质激活vir基因表达，vir基因表达产物作用于T-DNA使其产生T-DNA链，进一步形成T-DNA复合体进入细胞，此复合体在胞内蛋白与细菌蛋白的共同作用下进入细胞核，而后整合入植物基因组。 

经检索，目前尚无关于通过遗传工程技术来提高金银花种质的报告及对金银花不定芽转化获得转基因植株的方法。 

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种对金银花不定芽转化获得转基因植株的方法。 

本发明所述对金银花不定芽转化获得转基因植株的方法，包括金银花无菌苗的获得及培养、金银花茎段的预培养、含植物表达载体的农杆菌菌株的制备、农杆菌菌液活化及农杆菌侵染液制备、农杆菌侵染和共培养、农杆菌脱菌及诱导不定芽再生、金银花小芽的分割及生根、抗生素阳性苗的筛选、抗生素阳性苗的移栽及DNA提取、转基因植株的获得等步骤；具体是： 

（1）金银花无菌苗的获得及培养 

将金银花植株幼嫩枝芽剪下，用自来水冲洗30-40分钟，剪去叶片将茎段、切成2厘米左右的小段，用70%乙醇消毒1-5分钟，去净乙醇后用0.1%HgCl₂消毒10-15分钟，无菌水冲洗3-4遍。随后用无菌滤纸吸去水分后将茎段放置于固体培养基上，在22℃-25℃下 光照培养。其中所述固体培养基配方为：MS+0.1-1.0mg/L NAA(萘乙酸)+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8；所述MS配方为： 

（2）金银花茎段的预培养 

将培养20-30天的金银花无菌小苗剪去叶片及根，将茎切成0.5-1厘米的小段，每段含1-2个节，将茎段沿侧芽所在的轴线纵向切成两半，并切去可见的侧芽；再将经过上述处理的金银花茎段切面向下置于预培养固体培养基上，22℃-25℃下暗培养3-4天，备用；其中，上述预培养固体培养基配方为：MS+0.1-1.0mg/L NAA+25-30g/L蔗糖+7-8g/L琼脂，pH5.8； 

（3）含植物表达载体的农杆菌菌株的制备 

所选择AGL104农杆菌（载体购买自Invitrogen公司）为转化菌株制备农杆菌感受态细胞，在50μl农杆菌感受态细胞中加入含35S::C3’H过表达载体的质粒3ul，之后冰浴30±5分钟；放入液氮中1-5分钟，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5-8分钟；再加入800ulYEP，28±2℃、200-220rpm振荡培养3-4小时；取出菌液涂布于含利福平及壮观霉素的固体YEP 平板上，置28℃黑暗条件下倒置培养2-3天，待菌落大小可见后取菌体进行菌体PCR验证，对验证正确的菌体保存至4℃，备用；