[发明专利]一种对金银花不定芽转化获得转基因植株的方法

权利要求书

1.一种对金银花不定芽转化获得转基因植株的方法，步骤是：金银花无菌苗的获得及培养、金银花茎段的预培养、含植物表达载体的农杆菌菌株的制备、农杆菌菌液活化及农杆菌侵染液制备、农杆菌侵染和共培养、农杆菌脱菌及诱导不定芽再生、金银花小芽的分割及生根、抗生素阳性苗的筛选、抗生素阳性苗的移栽及DNA提取、转基因植株的获得；

其特征在于：

所述以金银花茎段预培养的方法是:将培养20-30天的金银花无菌小苗剪去叶片及根，将茎切成0.5-1厘米的小段，每段含1-2个节，将茎段沿侧芽所在的轴线纵向切成两半，并切去可见的侧芽，再将经过上述处理的金银花茎段切面向下置于预培养固体培养基上，22℃-25℃下暗培养3-4天，备用；

其中，上述预培养固体培养基配方为：MS+0.1-1.0mg/L NAA+25-30g/L蔗糖+7-8g/L琼脂，pH5.8；

所述含植物表达载体的农杆菌菌株的制备方法是：选择AGL104农杆菌为转化菌株制备农杆菌感受态细胞，在50μl农杆菌感受态细胞中加入含35S::C3’H过表达载体的质粒3ul，之后冰浴30±5分钟；放入液氮中1-5分钟，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5-8分钟；再加入800ulYEP，28±2℃、200-220rpm振荡培养3-4小时；取出菌液涂布于含利福平及壮观霉素的固体YEP平板上，置28℃条件下倒置培养2-3天，待菌落大小可见后取菌体进行菌体PCR验证，对验证正确的菌体保存至4℃，备用；其中，上述35S::C3’H过表达载体构建的方法是：将在金银花中克隆得到的C3’H基因，应用Gateway技术通过BP反应构建pDONR-C3’H入门载体，而后通过LR反应置换至pB2GW7载体上，获得35S::C3’H过表达载体；

所述农杆菌菌液活化及农杆菌侵染液制备的方法是：将制备的带有35S::C3’H过表达载体的农杆菌在添加了利福平及壮观霉素的YEP固体培养基上划线，28℃黑暗条件下培养2-3天后挑取单菌落，接入到含有利福平及壮观霉素的YEP液体培养基，28±2℃、200-220rpm振荡培养24小时后再次转接，再在黑暗条件下28±2℃、200-220rpm振荡培养16小时；将培养后的菌液置于灭菌的离心管中，6000rpm离心5分钟收集菌体，用5%蔗糖溶液重悬菌体，调整至OD600值为0.6-1.0，得到农杆菌侵染液；

所述农杆菌侵染和共培养的方法是：将上述暗培养后的金银花茎段在农杆菌侵染液中侵染10-15分钟，而后用无菌滤纸吸去菌液，切面朝下置于共培养培养基上，在黑暗条件下23℃-25℃培养3-4天；

其中，上述共培养培养基配方为：MS+0.1-1.0mg/L NAA+25-30g/L蔗糖+7-8g/L琼脂，pH5.8；

所述农杆菌脱菌及诱导不定芽再生的方法是：将上述共培养后的金银花茎段用无菌水清洗3-4次，再用无菌滤纸吸干，转接至不定芽诱导培养基上，在23℃-25℃、且每日光照14±2小时条件下，连续培养20±2天，分化出不定芽；

其中，上述不定芽诱导培养基配方为:MS+0.1-1.0mg/L KT+0.01-0.1mg/L NAA+20-30g/L蔗糖+7-8g/L琼脂，并添加200-300mg/L头孢噻肟钠，pH5.8；

所述金银花小芽的分割及生根的方法是：当金银花茎段上诱导再生的不定芽长至1厘米时，将小芽单独剪下，转移到生根培养基上，在23℃-25℃、且每日光照14±2小时条件下，培养14±1天，促使生根；

其中，上述生根培养基配方为：MS+0.1-1.0mg/L IAA+20-30g/L蔗糖+7-8g/L琼脂，并添加200-300mg/L头孢噻肟钠，pH5.8；

所述抗生素阳性苗的筛选的方法是：将已生出1-2厘米根的金银花小苗不伤及根部取出，转接到含抗生素Bar的筛选培养基上，在23℃-25℃、且每日光照14±2小时条件下，培养14±1天，存活苗即为抗生素阳性苗；

其中，上述抗生素筛选培养基配方为：MS+0.1-1.0mg/L NAA+20-30g/L蔗糖+7-8g/L琼脂，并添加200-300mg/L头孢噻肟钠和25-30mg/L Bar，pH5.8。

2.根据权利要求1所述对金银花不定芽转化获得转基因植株的方法，其特征在于：所述金银花预培养固体培养基配方为：MS+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂，pH5.8。