[发明专利]检测大肠杆菌致病血清型的引物及检测试剂盒

说明书

  

一、技术领域

本发明涉及检测大肠杆菌致病血清型的引物及检测试剂盒，属于生物和食品领域。

二、背景技术

能够导致人类腹泻的大肠杆菌依据它们毒力因子特性以及致病机制分为不同的致病型。肠致病性大肠杆菌（EPEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）、产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、肠聚集大肠杆菌（EAEC）、肠侵染性大肠杆菌（EIEC）是其中非常重要的五种致病型。这些致病型的大肠杆菌基本上都能够产生志贺毒素，故又称为产志贺毒素大肠杆菌（STEC）。 STEC是最重要的食源性病原菌，能够导致人类严重的疾病，诸如出血性肠炎（HC）和溶血尿毒综合征（HUS）等，个别患者可因急性和慢性肾功能衰竭而死亡。动物感染一般不引发明显的临床症状，但能够长期甚至终生携带。污染的肉品、奶制品以及蔬菜等食物是传播STEC主要的媒介。

人源和动物源的STEC可以产生两种毒素，分别为志贺毒素1（Stx1）和志贺毒素2(Stx2)，是引发HC和HUS的主要元凶。携带Stx2的STEC明显高于Stx1，并且Stx2能够分泌到菌体外，有着更严重的致病作用。Stx2有多个亚型Stx2c、Stx2d、Stx2e、Stx2f和stx2v，与菌株血清型和致病性有着密切关系。 

紧密素（intimin）是仅次于志贺毒素具有极强致病力的毒力因子，主要介导STEC在肠上皮细胞的定植，促进肌动蛋白聚合和基座样结构形成，造成严重的肠绒毛脱落，即A/E损伤。Intimin编码基因为eae，有27个亚型α1、α2、β1、β2、β3、ε1、ε2、ε3、ε4、η1、η2、θ、λ、μ、ν、ξ1、ξ3、ο、π、ρ、σ、τ1、τ2、б、γ1、γ2和κ，与菌株血清型和致病性有着密切关系。 

    建立能够快速而特异的检测致病性大肠杆菌的方法势在必行。随着抗生素的泛滥使用、导致菌株毒力基因更多变异，加之人类饮食结构的改变，更加重视食物营养的保留，食物被致病性大肠杆菌污染的几率增高、人类感染的机会也会随之更频繁。因此，选择stx2和eae两个基因设计引物，兼顾基因的多个亚型，建立二重PCR方法，鲜见报道。组装试剂盒，便于推广和使用。 

三、发现内容

技术问题  本发明目的在于建立能够检测大肠杆菌主要致病血清型的方法，进而组装成试剂盒，广泛推广和使用。本发明在基因选择和引物设计上注重通用性和简并性，扩增主要毒力基因stx2和eae以及它们的多个亚型，为致病性大肠杆菌的监测提供可靠的技术手段。

技术方案  本发明的具体实施方案如下： 

（1）引物设计

根据GenBank登陆的stx2、stx2c、stx2d、stx2e、stx2f和stx2v多个亚型基因序列设计通用引物，能够同时扩增出stx2主要的6个基因亚型，其上、下游引物序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；根据GenBank登陆的eaeα、eaeα2、eaeβ、eaeβ2、eaeβ3、eaeε、eaeε2、eaeε3、eaeε4、eaeη、eaeη2、eaeθ、eaeλ、eaeμ、eaeν、eaeξ、eaeο、eaeπ、eaeρ、eaeσ、eaeτ、eaeτ2、eaeб、eaeγ、eaeγ2和eaeκ多个基因亚型序列设计通用引物，能够同时扩增出eae多个亚型紧密素(eae)基因，其上、下游引物序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。引物序列如下：

SEQ ID NO.1：5- tcatcatatctggcgttaatgga-3                  

SEQ ID NO.2：5- tgtcgccagttatctgacattct-3                  

SEQ ID NO.3：5-ctggtgataatacccgtttagg-3              

SEQ ID NO.4：5-atccagaccgtatttgctctta-3  

（2）上述引物制备的试剂盒用检测大肠杆菌主要致病血清型的二重PCR方法，包括以下步骤：

① 待检模板的制备：粪便或者食物10克，打散或者研磨加入到90mL磷酸盐缓冲液中，37℃培养18小时，吸取1mL培养物，500 转离心10分钟，弃沉淀，吸取上清至新的离心管，12000转离心2分钟，弃上清，取沉淀重悬于1/10体积双蒸水中，沸水浴10分钟，4℃12000转 离心10分钟，吸取上清，即检测用模板DNA。