[发明专利]检测大肠杆菌致病血清型的引物及检测试剂盒

权利要求书

1.检测大肠杆菌致病血清型的引物：

志贺毒素2即stx2基因的检测上、下游序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

紧密素即eae基因的检测上、下游序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

SEQ ID NO.1：5- tcatcatatctggcgttaatgga-3                  

SEQ ID NO.2：5- tgtcgccagttatctgacattct-3                  

SEQ ID NO.3：5-ctggtgataatacccgtttagg-3              

SEQ ID NO.4：5-atccagaccgtatttgctctta-3

其中stx2基因的扩增产物为388bp，eae基因的扩增产物为609bp。

2.含有权利要求1所述引物的检测大肠杆菌致病血清型的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其用于检测大肠杆菌致病血清型毒力基因stx2和eae的二重PCR方法，包括以下步骤：

（1）待检模板的制备：粪便或者食物10克，打散或者研磨加入到90mL磷酸盐缓冲液中，37℃培养18小时，吸取1mL培养物，500 转离心10分钟，弃沉淀，吸取上清至新的离心管，12000转离心2分钟，弃上清，取沉淀重悬于1/10体积双蒸水中，沸水浴10分钟，4℃12000转离心10分钟，吸取上清，即检测用模板DNA；

（2）将stx2 上下游和eae上下游引物按照摩尔比1:2.5与PCR混合液一同加入到PCR反应管中，混合后加入待检样品DNA；

PCR混合液包括：采用25 uL的PCR反应体系，在0.2 mL的PCR反应管中分别加入10×PCR缓冲液2.5uL、2.5mM的dNTPs 2.0uL、25mM的MgCl₂ 1.5 uL、浓度为50pmol/uL 的stx2上下游引物各0.2 uL、浓度为50pmol/uL 的eae上下游引物各0.5 uL，5U/ uL DNA聚合酶0.5 uL、DNA模板5 uL、用灭菌超纯水加至总体积，混匀；

（3）将PCR管至于PCR仪中进行扩增；反应条件为：95℃预变性5分钟，94℃ 30秒，57℃ 30秒，72℃ 40秒，29个循环，72℃再延伸5分钟；

（4）将PCR产物于质量比为1%的琼脂糖凝胶上电泳；

（5）结果判定：

扩增产物如果有一条带388bp或609bp ，或者两条带388bp和609bp，即表示有大肠杆菌主要致病血清型的存在；

扩增产物如果没有条带388bp或609bp ，即表示无大肠杆菌主要致病血清型的存在。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，阳性模板200 uL、PCR混合液1mL、阴性对照200 uL，阳性模板为含有stx2和eae基因的大肠杆菌O157:H7基因组，浓度为0.63mg/mL。