[发明专利]以c-Cbl蛋白环状功能域为靶点的潜在药物的高通量筛选系统和筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种高通量筛选以c-Cbl蛋白环状功能域为靶标的潜在药物的方法。 

背景技术

Cbl（Casitas B-lineage lymphoma）蛋白是一类在生物体内广泛分布的细胞内蛋白，属于泛素连接酶E3系。c-Cbl在细胞内广泛表达，但主要存在于细胞质中。c-Cbl由N-端高度保守的酪氨酸激酶结合功能域（Tyrosine kinase binding domain，TKB)、环状功能域(RING)、富含脯氨酸功能域、C-端与泛素结合（Ubiquitin-associated，UBA）的功能域及与之重叠的亮氨酸拉链功能域组成。c-Cbl分子中的TKB及其他功能域可以识别并结合靶蛋白，RING功能域负责募集泛素结合酶E2，从而启动泛素化降解途径。c-Cbl通过调控信号蛋白参与细胞内信号转导的负向调控，这对于维持细胞的内稳态具有重要作用。 

2型糖尿病（旧称非胰岛素依赖型糖尿病或成人糖尿病），是一种严重的代谢性疾病，患者的主要特征为胰岛素抵抗、相对胰岛素缺乏和高血糖，常需要给予药物或胰岛素治疗，但也可通过增加体育运动和膳食控制病情。在发达国家，近年来2型糖尿病患者数迅速增加，美国疾病控制和预防中心已将2型糖尿病归入流行病之一。2型糖尿病过去在40岁以上的成年人中发病，而今越来越多的未成年人也身患此病，其原因可能是由于该年龄段的高肥胖率所致，2型糖尿病常与肥胖、高血压、高胆固醇（混合型高血脂症）以及“代谢综合征”（又称X综合症、Reavan's综合征、CHAOS综合症）相关，同时也与肢端肥大、柯兴氏综合征以及许多其他内分泌疾病相关。2型糖尿病复杂且多因素的代谢改变常导致多个器官的损伤和功能损害，其中最重要的累及部位即是心血管系统，导致患者心血管疾病发病率和死亡率显著上升，因此2型糖尿病已成为当前严重的世界性问题并引起了众多医生以及科研人员的关注，特别是对胰岛素的敏感度降低以及糖脂代谢的研究更是目前国际关注的热点之一。在过去的几十年里，一系列调控食欲、食物吸收以及增加肌肉组织或脂肪组织能量消耗的基因陆续被发现，其中c-Cbl基因就参与了全身能量消耗的调控。2004年Cooney GJ研究发现，c-Cbl在调控全身能量平衡中起着重要的作用。2006年，该组进一步发现证明c-Cbl通过调节胰岛素敏感度参与了全身能量平衡的调控以及c-Cbl泛素连接酶E3功能域参与了身 体能量平衡的调控。 

综上所述，c-Cbl环状功能域参与了机体能量平衡的调控，是潜在的治疗代谢性相关疾病的药物靶点，然而目前对c-Cbl环状功能域抑配基的研究尚为空白。如果我们能成功筛选出c-Cbl环状功能域的配基（以下简称c-Cbl环状功能域配基），那么通过拮抗或激动c-Cbl环状功能域的功能，从而对身体能量平衡进行调控，同时鉴定和确证c-Cbl环状功能域作为新的药物靶点的可能性，阐明c-Cbl的某些病理生理学意义，对于治疗糖尿病、动脉粥样硬化等疾病的新型药物研发以及为靶向c-Cbl环状功能域的药物研发提供科学依据和实践指导。 

基于荧光技术的检测分析方法是近年来被应用于药物高通量筛选（HTS）的重要方法之一，目前应用于HTS的荧光技术包括均相时间分辨荧光分析法、荧光共振能量传递分析法、荧光关联光谱法和极化荧光分析法。其中，用极化荧光分析法高通量筛选药物时，生物分子之间相互作用后不用过滤分离游离（未结合）的荧光标记物，检测极方便。极化荧光方法的理论是基于分子在均相溶液中的自由旋转，当一个荧光标记分子被一个平面的极化光所激发时，其发射光可发射到一个固定的平面，而该发射光的极化水平与分子的旋转速度成反比，小分子旋转速度快，其极化值小，大分子旋转速度慢，其极化值大。基于该理论，用荧光物质标记生物分子，当分子之间由于结合或解离，分子的体积或分子量发生变化时，引起的荧光信号反映的极化值发生变化，所以，可根据极化值的变化情况，考察分子之间的结合和解离。 

采用极化荧光方法高通量筛选以目标白为靶点的药物的方法，具体是将已有的靶标蛋白配基用荧光标记，与靶标蛋白混合，再加入待筛选样品，检测极化值，根据极化值确定带筛选样品是否竞争结合了靶标蛋白，确定待筛选样品作用于靶标蛋白。因此，实际筛选作用于靶标蛋白的潜在药物时，寻找与靶标蛋白亲和度高的配基非常关键，目前，未见高通量筛选以c-Cbl蛋白环状功能域为靶点的潜在药物的相关报道。 

发明内容

本发明提供了3种具有c-Cbl蛋白环状功能域高亲和度的多肽，以及以c-Cbl蛋白环状功能域为靶标的潜在药物的高通量筛选系统和筛选方法。 

本发明提供了氨基酸序列如SEQ ID NO.1～3任意一项所示的多肽。