[发明专利]制备HBV持续感染动物模型的试剂和方法

说明书

本发明涉及制备HBV持续感染动物模型的试剂和方法。本发明构建了可有条件地在小鼠肝脏诱导乙型肝炎病毒共价、闭合、环状DNA分子(cccDNA)的构建物，并成功建立一种HBV持续感染动物模型。

技术领域

本发明属于生物技术以及病毒学领域；更具体地，本发明涉及制备HBV持续感染动物模型的试剂和方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)慢性感染仍然是世界性公共健康问题，每年约有100万人死于乙肝感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝癌。中国是乙肝高发区，研究HBV慢性感染、发展有效的抗病毒治疗具有重大社会意义。

HBV易感宿主仅限于人和黑猩猩等灵长类动物，缺乏合适的实验动物模型一直是HBV病毒学和免疫学的研究瓶颈。小鼠是理想的实验模式动物，然而HBV并不感染小鼠。通过转基因技术，病毒抗原作为“自身”蛋白可以模拟乙肝慢性携带者体内的免疫耐受状态。基于HBV转基因小鼠的CTLs过继性输入(Adoptive transfer)能够模拟临床爆发性或急性肝炎的疾病过程，使人们对HBV急性感染的致病机制，特别是免疫系统控制病毒复制以及免疫病理有了深刻的理解。

尾静脉DNA高压注射(hydrodynamic injection)的非转基因小鼠模型近年来受到广泛的关注。Yang等(Proc Natl Acad Sci U S A99(2002)：13825-13830)应用尾静脉高压注射HBV编码质粒，由体内转染方式绕开潜在的病毒受体屏障，建立基于DNA质粒的肝细胞内病毒复制。约4-5%的小鼠肝细胞能够通过这一途径被有效转染，高效表达HBV病毒抗原；同时，病毒抗原作为“异己”成份能够激活病毒特异的宿主免疫应答，有效抑制病毒的表达并伴随肝细胞急性炎症损伤。值得注意的是，Huang等(Proc Natl Acad Sci U S A103(2006)：17862-17867)报道，应用腺相关病毒(AAV)载体构建HBV表达质粒，通过尾静脉高压注射C57BL/6小鼠，超过40%的小鼠在注射后6个月仍可检测到持续的HBsAg表达。然而需要指出，这一研究并未显示乙肝慢性病理特征，这种基于AAV载体的HBV持续性表达更类似于病毒健康携带者中的耐受状态。

共价、闭合、环状的cccDNA分子(covalently closed circularDNA)是HBV前基因组RNA复制的原始模板，虽然其含量较少，每个肝细胞内只有约5～50个拷贝，但对HBV复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义。由于cccDNA难以彻底清除，药物治疗终止后易出现病毒反跳现象，病人因此需要长期甚至终身接受核苷酸类似物等抗病毒治疗。只有清除了细胞核内的cccDNA，才能彻底消除乙肝患者病毒携带状态，是抗病毒治疗的重要目标。另一方面，低丰度的cccDNA检测存在技术难点，由于体系复杂和缺乏准确性，近年来发展的一系列PCR定量方法并不被广泛接受。

现有技术中，人们一般认为小鼠肝细胞中难以形成cccDNA，而基于HBV转基因的表达并不能够反映真实的细胞内病毒复制周期。因此，发展基于cccDNA的HBV持续感染小鼠模型具有重要的科学意义和实践价值。

发明内容

本发明的目的在于提供制备HBV持续感染动物模型的试剂和方法。

在本发明的第一方面，提供一种用于形成重组的乙型肝炎病毒共价、闭合、环状DNA分子(cccDNA)的方法，所述方法包括：

(1)提供一种构建物，所述构建物包括乙型肝炎病毒基因组序列，该乙型肝炎病毒基因组序列中插入一段外源的内含子(Intron)序列，该内含子序列包括(5’→3’)5’端拼接供体序列、3’端分枝点信号序列及拼接受体序列；并且，在5’端拼接供体序列与3’端分枝点信号序列及拼接受体之间，按照5’→3’依次包括质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列，所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列两端设置位点特异性重组元件(用于条件性敲除所述位点特异性重组元件之间的基因序列)；