[发明专利]制备HBV持续感染动物模型的试剂和方法

权利要求书

1.一种用于形成重组的乙型肝炎病毒共价、闭合、环状DNA分子的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供一种构建物，所述构建物包括乙型肝炎病毒基因组序列SEQ ID NO:1，该乙型肝炎病毒基因组序列中插入一段外源的内含子序列，该内含子序列包括5’端拼接供体序列、3’端分枝点信号序列及拼接受体序列；并且，在5’端拼接供体序列与3’端分枝点信号序列及拼接受体之间，按照5’→3’依次包括质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列，所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列两端设置位点特异性重组元件；所述的内含子序列插入于乙型肝炎病毒基因组nt202-203之间或nt2765-2766之间；

(2)将(1)的构建物转染肝细胞，诱导所述的位点特异性重组元件以敲除所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列，从而在肝细胞内形成重组的乙型肝炎病毒共价、闭合、环状DNA分子。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的5’端拼接供体序列包括：人β-globin基因第一内含子序列的5’端拼接供体序列，或人β2-microglobulin基因的第二内含子序列的5’端拼接供体序列。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的3’端分枝点信号序列及拼接受体序列是免疫球蛋白重链基因内含子的3’端分枝点信号序列及拼接受体序列；或人β2-microglobulin基因的第二内含子序列的3’端分枝点信号序列及拼接受体序列。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的质粒复制序列是pUC Ori；和/或

所述的真核基因加尾信号是牛生长激素因子基因的polyA加尾信号序列。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的位点特异性重组元件包括：

LoxP，且应用Cre重组酶诱导LoxP以敲除所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列；或

FRT，且应用FLP重组酶诱导FRT以敲除所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的构建物是表达载体。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：将(1)的构建物体外转染肝细胞，诱导所述的位点特异性重组元件以敲除所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列，从而在肝细胞内形成重组的乙型肝炎病毒共价、闭合、环状DNA分子。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，还包括共转下调CD1d表达的抑制分子。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的下调CD1d表达的抑制分子是特异性干扰CD1d表达的shRNA。

10.一种用于形成乙型肝炎病毒共价、闭合、环状DNA分子的构建物，其特征在于，所述构建物包括乙型肝炎病毒基因组序列SEQ ID NO:1，该乙型肝炎病毒基因组序列中插入一段外源的内含子序列，该内含子序列包括5’端拼接供体序列、3’端分枝点信号序列及拼接受体序列；并且，在5’端拼接供体序列与3’端分枝点信号序列及拼接受体序列之间，按照5’→3’依次包括质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列，所述的质粒复制序列、抗性筛选基因序列和真核基因加尾信号序列两端设置位点特异性重组元件；所述的内含子序列插入于乙型肝炎病毒基因组nt202-203之间或nt2765-2766之间。