[发明专利]一种基于G-四链体核酸酶的毒素检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于G-四链体核酸酶的微囊藻毒素(MC-LR)检测新方法, 属于免疫分析化学技术领域。 

背景技术

G-四链体是含有丰富鸟嘌呤的核酸序列，由Hoogsteen类型碱基配对形成的四条高度有序的核酸链的稳定结构。这些四链体结构曾因为其具有深远意义的生物学活性而被作为基因的启动子。最近几年来，基于G-四链体的DNA酶，由血晶素和G-四链体形成的复合物，体现出了令人惊讶生物催化能力。先前的研究已经发现基于G-四链体的DNA酶具有类似于过氧化物酶的性质，能够有效的催化双氧水参与的氧化ABTS或者TMB的反应，最终形成有色的产物。因此，基于G-四链体的DNA酶被广泛的应用于生物医学和生物催化领域，如用于对核酸的检测、蛋白质的检测、金属离子的检测和有机分子的检测等。 

酶联免疫反应(The enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是一种传统的免疫检测方法普遍的应用在生命科学里，应用包括进行疾病的诊断、检测生物活性分子等。但是，此方法仍有一些问题没有解决。修饰到抗体上的酶对试验中的温度和pH非常敏感，且此方法的灵敏度还有待进一步提高。寻找酶的替代物用于检测方法一直是活跃的研究内容。有文献报道，磁纳米粒子(Magnetic nanoparticles ，MNPs)因其拥有内在的模拟酶的活性而被应用于免疫检测法。尽管磁纳米粒子在检测上具有一些优势，如稳定性较高，并且易于分离，但是磁纳米粒子的制备比较复杂且需要专门的技术人员。 

随着经济的发展,含有大量的氮、磷营养物质的污水进入湖泊、水库,使水体富营养化,致使藻类异常增殖，释放次级代谢物藻毒素（Algae Toxins），威胁人类的饮用水的安全和水体中其它生物的安全。其中微囊藻毒素(Microcystins,MCs) 分布最广、危害最大，近年来，许多大型的中毒事件都以藻毒素污染相关，因此，它受到了公众的广泛关注。但目前未见其用于微囊藻毒素(MC-LR)的检测。 

为了人体健康和安全考虑，世界卫生组织(World Health Organization， WHO)要求藻毒素在日常饮用水中的含量必须小于1 μg/L。因此，提出一种科学、合理且快速的检测方法具有重大的实际意义。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于G-四链体核酸酶的微囊藻毒素(MC-LR)检测方法，选用基于G-四链体的DNA酶作为一种新型标记物来开发针对藻毒素的免疫检测法。G-四链体结合到血晶素上后展示出优秀的类似过氧化酶活性。金纳米粒子(gold nanoparticles， AuNPs)作为载体，偶联G-四链体又可以大大提高检测方法的检测限。所述方法可实现水中藻毒素的简单、快速、高灵敏检测。 

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明的技术方案：一种基于G-四链体核酸酶的微囊藻毒素(MC-LR)检测方法，包括金纳米粒子（AuNPs）的合成及其功能化、四链体（DNA和血晶素复合物）的制备、四链体偶联抗体的探针(DNA-AuNPs-antibody (Ab))的装配、反应条件的优化和抑制曲线的建立及实际样本的检测。 

工艺步骤为： 

(1) 金纳米粒子的合成；

参照Frens的柠檬酸三钠还原法合成直径为25纳米的金纳米粒子；

 (2) 金纳米粒子的功能化； 

将巯基修饰的DNA溶液加入到纳米金粒子溶液中，缓慢加入氯化钠溶液，室温反应10-15小时，得金纳米粒子-核酸偶联物，完成金纳米粒子的功能化； 

(3)DNA和血晶素复合物的制备；

向金纳米粒子-核酸偶联物中加入血晶素，使偶联在金纳米粒子表面的DNA在血晶素作用下折叠形成四链体结构，最终得到DNA和血晶素复合物，即具有类过氧化物酶性质的四链体复合物；

(4) 四链体偶联抗体的探针(DNA-AuNPs-antibody (Ab))的装配；

将金纳米粒子上的四链体复合物与抗体偶联得到最终的检测探针(DNA-AuNPs-antibody (Ab))；

 (5) 检测标准曲线的建立；

采用基于G-四链体的间接竞争免疫检测方法来分析藻毒素，将抗藻毒素的抗体和稀释的藻毒素的标准品溶液加入到含有包被原的酶标板孔里，通过抗体、微囊藻毒素MC-LR、包被原的竞争过程，将DNA-AuNPs-Ab探针加入到孔里与藻毒素抗体反应，最后四链体催化双氧水介导的氧化ABTS的反应，反应结束后检测各个孔的有色产物的吸光值来绘制标准曲线；