[发明专利]一种基于G-四链体核酸酶的毒素检测方法

权利要求书

1. 一种基于G-四链体核酸酶的微囊藻毒素检测方法，包括如下步骤：

(1) 金纳米粒子的合成；

参照Frens的柠檬酸三钠还原法合成直径为25纳米的金纳米粒子；

 (2) 金纳米粒子的功能化； 

将巯基修饰的DNA溶液加入到纳米金粒子溶液中，缓慢加入氯化钠溶液，室温反应10-15小时，得金纳米粒子-核酸偶联物，完成金纳米粒子的功能化； 

(3)DNA和血晶素复合物的制备；

向金纳米粒子-核酸偶联物中加入血晶素，使偶联在金纳米粒子表面的DNA在血晶素作用下折叠形成四链体结构，最终得到DNA和血晶素复合物，即具有类过氧化物酶性质的四链体复合物DNA-AuNPs；

(4) 四链体偶联抗体的探针的装配；

将金纳米粒子上的四链体复合物与抗体偶联得到最终的检测探针DNA-AuNPs-Ab；

(5) 标准曲线的建立；

将抗藻毒素的抗体和稀释的藻毒素MC-LR的标准品溶液加入到含有包被原的酶标板孔里，通过抗体、微囊藻毒素MC-LR、包被原的竞争过程，将DNA-AuNPs-Ab探针加入到孔里与藻毒素抗体反应，最后四链体催化双氧水介导的氧化ABTS的反应，反应结束后检测各个孔的有色产物的吸光值来绘制标准曲线；

运用MC-LR的浓度作为横坐标，反应液的中信号分子的强度，吸光值作为纵坐标建立抑制标准曲线；检测限(LOD) 通过公式 LOD=3.3SD/S计算得出，SD 为变异系数，S是标准曲线的斜率，构建标准曲线；

(6) 对样品进行检测；

以待测样品取代步骤（5）中的藻毒素MC-LR的标准品进行同样的反应，最后得到吸光值数值，再根据检测标准曲线建立的标准曲线回归方程计算出待测样品中藻毒素的含量。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤1具体为：将配制的1.0 mM氯金酸溶液50 mL加到锥形瓶瓶中，置于恒温电磁搅拌器上加热至沸腾后持续5-10分钟，迅速加入0.6 mL，38.8 mM的柠檬酸三钠溶液，继续搅拌加热4-6分钟，溶液的颜色由淡黄色转变到酒红色，此时金纳米粒子生成，继续加热10-15分钟后停止，继续搅拌使其冷却，4℃保存备用。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于：所述步骤2中金纳米粒子的功能化具体操作步骤为：将10-20 μL 100 mM 巯基修饰的DNA溶液加入到980 μL的金纳米粒子溶液中，充分震荡混匀；缓慢加入氯化钠溶液至在上述溶液中的终浓度达到20-50 mM，室温反应10-15小时，接着将金纳米粒子-核酸偶联物12000 g，离心30分钟，去除未结合到今纳米粒子上去的核酸，沉淀重悬在10 mM pH 7.4的Tris-HAc 缓冲液中，所述缓冲液中含有 5 mM KAc 和体积浓度为 0.002%的 TritonX-100。

4. 根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于：所述步骤3中DNA和血晶素复合物的制备具体为：将DNA 浓度为2 μM的金纳米粒子-核酸偶联物() 分散在10 mM, pH 7.4的Tris-HAc 缓冲液中，该缓冲液中含有5 mM KAc 和体积浓度为 0.002%的 TritonX-100，将溶液加热到90℃保持5分钟，后冷却到室温反应30分钟；将2 μM血晶素加入到以上的混合溶液中去，充分混匀，继续室温孵育1小时，形成DNA和血晶素复合物即四链体复合物DNA-AuNPs。

5. 根据权利要求1-4任一项所述的检测方法，其特征在于：所述步骤4具体为：将20 μL 经纯化的1 mg/mL的羊抗兔多抗加入到1 mL 四链体复合物DNA-AuNPs溶液中，用0.1M的碳酸钾将pH调节到8.0-8.5；经过15分钟温和的震荡混匀，加入20 μL， 质量体积浓度为10%的小牛血清BSA溶液，封闭金纳米粒子上未结合抗体的部位，继续搅拌30分钟；混合物4℃在反应2小时，8000 g离心30分钟以去除多余的抗体；最后沉淀重复离心两次，每次重悬在10 mM pH 7.4的Tris-HAc 缓冲液中，所述缓冲液中含有 10 mM KAc 和 体积浓度为0.002% 的TritonX-100；最终，DNA-AuNPs-Ab探针储存在Tris-HAc缓冲液中，4℃保存，备用。