[发明专利]激酶Lats2在调控前体脂肪细胞增殖中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学、细胞生物学和细胞信号转导领域，具体地说，涉及激酶Lats2及Hippo信号通路在调控前体脂肪细胞增殖中的应用。

背景技术

在生物体内，脂肪组织主要分布在皮下和器官周围，称为皮下脂肪垫和围器官脂肪垫，这些脂肪垫对于维持动物体温平衡和保护器官具有重要的作用。在生物体系统中脂肪组织发挥着举足轻重的作用，其主要作用为维持机体的能量平衡，以甘油三酯的形式储存多余能量，当能量消耗大于能量摄入时，动员脂肪将能量以游离脂肪酸和甘油的形式释放出来继续代谢产能。此外，皮下脂肪可以保持动物体温，对机械碰撞也具有缓冲作用。由于脂肪组织对于机体具有重要的作用，因此对脂肪发育调控机制的研究也显得尤为重要。

Hippo信号通路首先在果蝇中发现，在哺乳动物中也存在这样的通路，在物种间高度保守。Hippo信号通路控制器官的大小，是一种激酶级联反应，由一些对生长起负调节作用的因子组成，最终引起转录辅活化子的磷酸化和失活，从而调控一些靶基因的表达，抑制细胞增殖和控制器官大小。

Lats2属于Ser/Thr激酶的AGC家族，C-端激酶结构域高度保守。Lats2作为Hippo信号通路中的一个核心激酶，通过与下游的转录辅助因子YAP和TAZ相互作用从而调控靶基因的表达，对细胞的增殖和凋亡发挥调控作用。

Hippo信号通路和激酶Lats2参与多种组织和器官的发育调控，但是对于脂肪组织的发育调控却没有明确的报道。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供激酶Lats2及Hippo信号通路在控制动物脂肪发育中的新用途。

本发明提供了激酶Lats2在调控动物脂肪细胞增殖中的应用，所述应用为过表达激酶Lats2，激活Hippo信号通路，从而抑制动物脂肪细胞增殖。

优选地，所述脂肪细胞为前体脂肪细胞。

所述动物为哺乳动物。优选地，所述动物为小鼠、牛或羊。

本发明还提供了一种过表达激酶Lats2的小鼠前体脂肪细胞的制备方法，所述方法包括如下步骤：

（1）提取小鼠大脑组织RNA，反转录成cDNA，以cDNA为模板，以引物F1和R1为引导进行PCR扩增，获得Lats2基因；引物F1：AGATCTATGAGGCCAAAGACTTTTCC（SEQ ID No.1）；引物R1：CTCGAGTTACACGTACACCGGCTGGC（SEQ ID No.2）；

（2）将Lats2基因克隆至表达载体pPB-CAG-EBNXN，获得重组表达载体pPB-CAG-EBNXN-Lats2；

（3）将重组表达载体pPB-CAG-EBNXN-Lats2转染小鼠前体脂肪细胞，药物筛选得到稳定整合Lats2的细胞，即得到过表达激酶Lats2的小鼠前体脂肪细胞。

步骤（1）中，反转录成cDNA的方法为M-MLV反转录酶反转录方法。

步骤（1）中，PCR扩增所用引物为F1和R1，PCR扩增的反应体系为50微升KOD高保真酶PCR扩增体系：

PCR扩增的反应程序为：

步骤（2）中，重组表达载体pPB-CAG-EBNXN-Lats2的制备方法为将步骤（1）中的PCR产物与表达载体pPB-CAG-EBNXN分别进行BglII和XhoI双酶切，PCR产物目的片段和表达载体pPB-CAG-EBNXN骨架的酶切产物分别回收后用T4 DNA连接酶连接，得到重组表达载体pPB-CAG-EBNXN-Lats2。

步骤（3）中，所述药物筛选为嘌呤霉素药物筛选，可采用本领域常规方法。

步骤（3）中转染的方法为本领域常规方法。

本发明还提供了激酶Lats2在减少动物脂肪沉积，提高瘦肉率中的应用。

本发明还提供了激酶Lats2在动物优化遗传育种中的应用。

另外，本发明还形成了一套研究Lats2调控前体脂肪细胞增殖的方法：

1、构建Lats2真核表达载体并获得高水平表达Lats2的前体脂肪细胞系

提取小鼠大脑组织RNA，反转录成cDNA后用高保真酶进行PCR扩增获得Lats2的CDS区，将其连接到表达载体pPB-CAG-EBNXN上，获得重组表达载体。将重组表达载体转染前体脂肪细胞筛选到稳定整合Lats2的细胞，得到过表达Lats2的前体脂肪细胞。

用Western blot实验检验Lats2和Lats2的活性形式p-Lats2的表达水平。