[发明专利]一种人胰岛素酯的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于人胰岛素制备工艺领域，特别涉及一种人胰岛素酯的制备方法。

背景技术

随着人口老龄化、饮食失调、运动减少和肥胖人数的持续增多，无论在发达国家或是发展中国家，糖尿病的发病率将越来越高。目前全球有超过3.6亿糖尿病病人，糖尿病已成为继癌症和心血管疾病之后的第三大死亡原因。同时糖尿病是一个沉默的杀手，糖尿病慢性并发症现已成为造成糖尿病人致残或过早死亡的主要原因，其早期很多症状易被忽略，而晚期的并发症又带给人很多痛苦。

目前我国糖尿病的患者数量已经接近一亿人。目前临床应用中，胰岛素是降低体内血糖最有效的药物，一型糖尿病患者和严重的二型糖尿病患者都必须注射胰岛素，补充胰岛素以控制血糖的水平，提高患者的生活质量的同时降低糖尿病并发症的发生。我国胰岛素的市场95%的由国外厂商垄断，价格比较昂贵，严重影响到我国糖尿病用药的安全；同时由于国外公司把持我国胰岛素市场，导致胰岛素在我国糖尿病患者的使用率较低。为了打破国外厂商对于我国胰岛素市场的垄断，提高国产重组人胰岛素的竞争优势，势必需要对现有的重组人胰岛素生产工艺进行革新，以降低生产成本。

重组人胰岛素的目前有两种生产工艺，一种采用大肠杆菌的表达系统，表达的产物在菌体中以包涵体的形式存在，在后期的工艺中进行复性，酶切后得到重组人胰岛素，该工艺的难点在于包涵体的复性难度较大，而且蛋白浓度不能太高，因而工业放大较困难；第二种采用酵母的表达系统，目前通用的是酿酒酵母和毕赤酵母表达系统，是将外源基因整合到酵母基因组中，表达产物可以分泌到发酵的上清中，而且容易实现高密度发酵。但是采用酵母的表达系统的难点是表达的分子中不含有B链30位的Thr，因而需要后期的转肽反应，人工将苏氨酸连接到B链29位Lys的C端。转肽反应体系中需要大量的胰蛋白酶和苏氨酸酯，这两个物质的成本较高。如果我们在现有的反应体系中，提高反应中的胰岛素的浓度，可以增加单位反应的产量，减少胰蛋白酶和苏氨酸酯的用量，同时可以减少设备投入。

发明内容

为克服上述的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种人胰岛素酯的制备方法。本发明克服现有胰岛素转肽反应中胰岛素浓度较低的缺陷。通过工艺的调整，成功实现高浓度胰岛素13mM～33mM的转肽反应，同时反应还保持较高的转化收率。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种人胰岛素酯的制备方法，包括以下步骤：

（1）从含有desB₃₀人胰岛素的溶液，离心或抽滤得到desB₃₀人胰岛素含水粉末；

（2）使用desB₃₀人胰岛素含水粉末进行转肽反应，得到人胰岛素酯；其中，desB₃₀人胰岛素在转肽反应体系中的终浓度为13mM～33mM；

步骤（1）中所述的desB₃₀人胰岛素是指去除B链30位苏氨酸的人胰岛素；

步骤（1）中所述的含有desB₃₀人胰岛素的溶液可以来自真核细胞（如酿酒酵母或毕赤酵母）表达的人胰岛素原，经过胰蛋白酶酶切反应去除C肽和胰岛素B链30位氨基酸的反应溶液；或是来自原核细胞（大肠杆菌）表达的包涵体，复性后得到的人胰岛素原，经过胰蛋白酶酶切反应去除C肽和胰岛素B链30位氨基酸的反应溶液；或是以直接用desB₃₀人胰岛素的粉末直接溶于水溶液中得到的溶液；

步骤（1）中所述的离心或抽滤之前，先对含有desB₃₀人胰岛素的溶液进行沉淀；

所述的对含有desB₃₀人胰岛素的溶液进行沉淀的方式优选为调节pH值之后静置沉淀，或是先加入Zn²⁺，再调节pH值，之后静置沉淀；

所述的pH值为5.6～6，更优选为5.8；

所述的调节pH值的试剂可以为磷酸、醋酸和氨水中的一种或至少两种；

所述的Zn²⁺可由氯化锌或硫酸锌提供；

所述的Zn²⁺的用量按desB₃₀人胰岛素与Zn²⁺的摩尔比为1：0.5～1.5进行计算添加；

所述的静置的温度优选为4～8℃；

步骤（1）中所述的抽滤使用的滤膜优选为300目；