[发明专利]一种重组人胰岛素的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于胰岛素制备领域，特别涉及一种重组人胰岛素的制备方法。

背景技术

目前，据国际糖尿病联盟2011年统计，全球糖尿病患病人数为3.66亿，预计2030年将达到5.52亿，相当于每十秒钟增加一名糖尿病患者，或者每年增加一千万名患者。在我国，糖尿病的患病率在近10年翻了近两倍。2010年，我国成人糖尿病的患病率为9.7%，患者总数已超过9000万，成为世界第一糖尿病大国;同时，糖尿病前期的糖耐量受损人群达到了1亿4千8百万人，患病率为15.5%。所以用胰岛素治疗糖尿病市场巨大。

目前临床应用中，胰岛素是降低体内血糖最有效的药物，一型糖尿病患者和严重的二型糖尿病患者都必须注射胰岛素，补充胰岛素以控制血糖的水平，提高患者的生活质量的同时降低糖尿病并发症的发生。我国胰岛素的市场95%的由国外厂商垄断，价格比较昂贵，严重影响到我国糖尿病用药的安全；同时由于国外公司把持我国胰岛素市场，导致胰岛素在我国糖尿病患者的使用率较低。为了打破国外厂商对于我国胰岛素市场的垄断，提高国产重组人胰岛素的竞争优势，势必需要对现有的重组人胰岛素生产工艺进行革新，以降低生产成本。

目前重组人胰岛素及其类似物的生产采用了两套系统，其一是用酵母系统（CN1414974A；CN1873006A；CN1125081C）；其二是用大肠杆菌系统（CN1163600C；CN1011073006A）。酵母系统采用了分泌人胰岛素原类似物的方式，分泌出来的人胰岛素前体已具有了天然的二硫键及正确的N-端。缺点在于酵母菌生长慢，导致生产周期长，且表达水平很低。应用大肠杆菌表达重组人胰岛素生产的方式主要包括三种方式：一种是美国礼来公司1982年采用的重组大肠杆菌分别表达胰岛素的A链和B链，表达产物经溴化氰（bromine cyanide,CNBr）切下融合导肽片段后，得到的A链和B链经纯化后再进行复性，最后得到有活性的重组人胰岛素。由于该方式的复性率只有10%左右，采用这条工艺生产的胰岛素成本太高。第二种也是美国礼来公司建立的，目前仍然是诸多公司生产重组人胰岛素的主要方式。由于正常序列的人胰岛素原（B-C-A）在大肠杆菌中不稳定而容易降解，通常采用融合蛋白的形式，将人胰岛素原接在一个较大的N-端融合蛋白后面，大大增加了胰岛素原的表达量（10%-30%）（Castellanos-Serra,et al.1996;Tikhonov,et al.2001），表达产物通过溴化氰释放出人胰岛素原。由于C肽的存在，胰岛素原能形成良好的空间构象，折叠率达到70%，从而在一定程度上降低了胰岛素的生产成本。第三种方式是丹麦诺和诺德公司采用的A、B链同时表达的方法，在A链前端和A、B链中间均有甲硫氨酸。表达产物经溴化氰处理，得到A链和B链，再经过复性和纯化得到有活性的重组人胰岛素，这种方式与第一种方式存在着同样的因为复性效率带来的成本问题。

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是目前进行胰岛素前体表达来进行胰岛素生产的热点，也是近十年来受到广大研究者的青睐。主要原因是：一、该表达系统同时兼有原核表达系统和真核表达系统的优点；二、培养操作容易，生长速度快，表达量高，产物不会过度糖基化，蛋白抗原性低。

虽然，用毕赤酵母表达生产重组人胰岛素前体量高，但是最重要的步骤是转肽，该步骤最为明显的是成本高、收率低、时间长，要想产品有竞争力，降低成本、提高收率将是我们转肽重点。

在已经报道的文献中，转肽反应都是在少水的有机相中一步进行完成的。常用的有机溶剂：DMF（N、N-二甲基甲酰胺）、DMA（N、N-二甲基乙酰胺）、DMSO（二甲基亚砜）、1,4-丁二醇、THF（四氢呋喃）或二氧六环等。为了提高收率减少转肽反应时间，叔丁醚苏氨酸叔丁酯与重组人胰岛素前体的摩尔比达到近100：1甚至更高。而胰蛋白酶与重组人胰岛素前体的质量比也将近1：5，虽然加的酶量很高，但是转肽反应时间一般都要10小时以上，也是因为反应时间长反应生产出来的杂质也很多，这样对后序纯化带来了麻烦和压力，同时使整个下游工序成本升高，收率降低。

在国家发明专利申请CN102703552A中披露了采用两步法代替一步法的胰岛素生产工艺的具有提高的转化效率，降低整个生产工艺的成本。但是工艺开发过程中，采用了两次冻干的工艺，不适合工业的放大和成本的降低，另外转肽反应中胰岛素的浓度比较低，为2.5～10mM。在专利CN100424179C中也提到了采用先酶切后转肽的思路，其酶切后的产物不需要分离，其具有技术上的优势，但是从酶切体系转换成转肽体系中，需要添加入大量的有机化合物，同时也降低了转肽反应的胰岛素浓度（约5mM）。