[发明专利]一种重组人胰岛素的制备方法

权利要求书

1.一种重组人胰岛素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）在有机溶剂与水的混合溶液中对重组人胰岛素前体进行酶切反应，得到含有desB₃₀人胰岛素溶液；

（2）从含有desB₃₀人胰岛素的溶液，离心或抽滤得到desB₃₀人胰岛素含水粉末；

（3）使用desB₃₀人胰岛素含水粉末进行转肽反应，得到人胰岛素酯；其中，desB₃₀人胰岛素在转肽反应体系中的终浓度为12.1mM～33mM；

（4）将重组人胰岛素酯脱酯，即得重组人胰岛素。

2.根据权利要求1所述的重组人胰岛素的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的有机溶剂的浓度为体积百分比0.1～30%；

所述的有机溶剂为异丙醇或乙醇。

3.根据权利要求1所述的重组人胰岛素的制备方法，其特征在于：步骤（1）为：在有机溶剂与水的混合溶液中对重组人胰岛素前体进行酶切反应，酶切的条件为将pH值调节为7～9，于20～30℃反应，得到含有人胰岛素B链第30位缺少苏氨酸的人胰岛素溶液；其中，胰蛋白酶与重组人胰岛素前体按质量比1：50～500配比。

4.根据权利要求3所述的重组人胰岛素的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的反应的时间为1～8小时；

步骤（1）中所述的pH值用氨水调节；

所述的胰蛋白酶与所述的重组人胰岛素前体按质量比1：300配比。

5.根据权利要求1所述的重组人胰岛素的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的离心或抽滤之前，先对含有desB₃₀人胰岛素的溶液进行沉淀。

6.根据权利要求5所述的重组人胰岛素的制备方法，其特征在于：所述的对含有desB₃₀人胰岛素的溶液进行沉淀的方式为调节pH值之后静置沉淀，或是先加入Zn²⁺，再调节pH值，之后静置沉淀。

7.根据权利要求6所述的重组人胰岛素的制备方法，其特征在于：所述的pH值为5.6～6；

所述的调节pH值的试剂可以为磷酸、醋酸和氨水中一种或至少两种；

所述的Zn²⁺的用量按desB₃₀人胰岛素与Zn²⁺的摩尔比为1：0.5～1.5进行计算添加；

所述的静置的温度为4～8℃。

8.根据权利要求1所述的重组人胰岛素的制备方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的转肽反应包括如下步骤：用二甲基亚砜溶解苏氨酸或其衍生物，以及desB₃₀人胰岛素含水粉末，再加入1,4-丁二醇和胰蛋白酶水溶液或是只加入胰蛋白酶水溶液，获得转肽的反应体系；然后搅拌进行反应；

desB₃₀人胰岛素与苏氨酸酯或其衍生物的摩尔比为1：15～150，desB₃₀人胰岛素与胰蛋白酶按质量比为10～80：1。

9.根据权利要求8所述的重组人胰岛素的制备方法，其特征在于：

所述的苏氨酸酯为o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯；

所述的衍生物指的是o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯盐类衍生物；

所述的反应体系中溶剂的比例为二甲基亚砜：1,4-丁二醇：水按体积比15%～50%：0～65%：20%～50%；其中水的含量中包含了desB₃₀人胰岛素含水粉末中包含的水分。

10.根据权利要求1所述的重组人胰岛素的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述的脱酯为采用三氟乙酸试剂进行脱酯。