[发明专利]柳枝稷木质素合成酶基因PvCCoAOMT全长cDNA及其克隆方法

说明书

技术领域

本发明属于柳枝稷分子育种技术领域，具体涉及柳枝稷木质素合成酶基因PvCCoAOMT全长cDNA及其克隆方法。

背景技术

柳枝稷是多年生禾本科、稷属、C4草本植物，起源于美国，作为纤维素乙醇转化的模式植物之一，具有适应性广泛、产量高、耐贫瘠、高光合利用率及高水氮利用率等优点。但其高木质素含量及复杂的结构限制了纤维素和半纤维素的水解，降低了糖化效率，增大纤维素转化乙醇的生产成本。拟解决的方法是利用生物技术手段，下调控制木质素合成的相关基因，减少木质素含量，改变木质素组成。

CCoAOMT基因是控制木质素合成的关键酶之一，主要控制木质素G单体的形成。利用基因工程手段调控该基因对改变木质素单体的组成有重要作用。目前通过RNAi技术下调CCoAOMT基因已经在许多高等植物上得到应用，如烟草、拟南芥、苜蓿、杨树等，其中在转基因苜蓿上取得较好成果：木质素含量下降、木质素单体的改变利于其降解、纤维素转化效率显著提高。因此，克隆该基因是试验的前提。目前，CCoAOMT基因已经在许多植物，包括高粱、水稻、玉米、小麦、大麦、烟草、苜蓿、二穗短柄草、毛竹和刺竹等中克隆。然而，有关柳枝稷PvCCoAOMT基因的克隆，发现Shen等在Genbank上传的CCoAOMT1b序列，仅包含开放阅读框（ORF），而无5'和3'的非编码区，不利于在非编码区进行引物设计、构建融合表达载体等。

因此，克隆出柳枝稷木质素合成酶基因PvCCoAOMT全长cDNA，为开展柳枝稷PvCCoAOMT基因表达载体的构建、过表达或抑制表达PvCCoAOMT基因等遗传转化研究提供方便，能够改良木质素成分，提高纤维素转化乙醇的效率，加快生物质能源开发利用。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供柳枝稷木质素合成酶基因PvCCoAOMT全长cDNA及其克隆方法。

本发明提供了所述柳枝稷木质素合成酶基因PvCCoAOMT全长cDNA，所述全长cDNA具有（1）或（2）所示的核苷酸序列：

（1）SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

（2）SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸而形成的具有同等功能的核苷酸序列。

本发明还提供了所述柳枝稷木质素合成酶基因PvCCoAOMT全长cDNA编码的木质素合成酶蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

所述柳枝稷木质素合成酶基因PvCCoAOMT全长cDNA大小为1005bp，包含一个777bp的完整的开放阅读框（ORF），其5'UTR大小为96bp，3'UTR大小为132bp，编码258个氨基酸。

本发明还提供了所述柳枝稷木质素合成酶基因PvCCoAOMT全长cDNA的克隆方法，所述方法为结合同源克隆和5'RACE克隆技术，分别获得带有重叠部分序列的柳枝稷PvCCoAOMT基因片段，再进行序列拼接，获得该基因全长cDNA。

具体的，所述柳枝稷木质素合成酶基因PvCCoAOMT全长cDNA的克隆方法，包括如下步骤：

（一）同源克隆技术获得柳枝稷PvCCoAOMT基因核心片段；

（二）5'RACE克隆技术获得柳枝稷PvCCoAOMT基因5'RACE的cDNA片段；

（三）序列拼接：将利用同源克隆方法获得的柳枝稷PvCCoAOMT基因核心片段和利用5'RACE克隆方法获得的cDNA片段进行比对、拼接，获得柳枝稷木质素合成酶基因PvCCoAOMT全长cDNA。

其中，步骤（一）同源克隆技术获得柳枝稷PvCCoAOMT基因核心片段，包括如下步骤：

（1）提取柳枝稷总RNA，进行RNA完整性和纯度检测，反转录成cDNA；

（2）设计扩增柳枝稷PvCCoAOMT基因核心片段的特异性引物：

正向引物：5'-GAGCCGGAGAGCATGAAGGAG-3'（SEQ ID No.5）

反向引物：5'-GGGGCAAGAAAGAGCCAAAAA-3'（SEQ ID No.6）；

（3）以步骤（1）获得的cDNA为模板，以步骤（2）设计的特异性引物对为引导进行PCR扩增反应；

（4）回收和纯化步骤（3）扩增的PCR产物；

（5）PCR产物与T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞；

（6）筛选阳性克隆，并进行序列测定与分析，获得柳枝稷PvCCoAOMT基因核心片段。