[发明专利]柳枝稷木质素合成酶基因PvCCoAOMT全长cDNA及其克隆方法

权利要求书

1.柳枝稷木质素合成酶基因PvCCoAOMT全长cDNA，其特征在于，所述全长cDNA具有（1）或（2）所示的核苷酸序列：

（1）SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

（2）SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸而形成的具有同等功能的核苷酸序列。

2.权利要求1所述柳枝稷木质素合成酶基因PvCCoAOMT全长cDNA编码的木质素合成酶蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.权利要求1所述柳枝稷木质素合成酶基因PvCCoAOMT全长cDNA的克隆方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（一）同源克隆技术获得柳枝稷PvCCoAOMT基因核心片段；

（二）5'RACE克隆技术获得柳枝稷PvCCoAOMT基因5'RACE的cDNA片段；

（三）序列拼接：将利用同源克隆方法获得的柳枝稷PvCCoAOMT基因核心片段和利用5'RACE克隆方法获得的cDNA片段进行比对、拼接，获得柳枝稷木质素合成酶基因PvCCoAOMT全长cDNA。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（一）同源克隆技术获得柳枝稷PvCCoAOMT基因核心片段，包括如下步骤：

（1）提取柳枝稷总RNA，进行RNA完整性和纯度检测，反转录成cDNA；

（2）设计扩增柳枝稷PvCCoAOMT基因核心片段的特异性引物：

正向引物：5'-GAGCCGGAGAGCATGAAGGAG-3'

反向引物：5'-GGGGCAAGAAAGAGCCAAAAA-3'；

（3）以步骤（1）获得的cDNA为模板，以步骤（2）设计的特异性引物对为引导进行PCR扩增反应；

（4）回收和纯化步骤（3）扩增的PCR产物；

（5）PCR产物与T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞；

（6）筛选阳性克隆，并进行序列测定与分析，获得柳枝稷PvCCoAOMT基因核心片段。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的PCR扩增反应的反应体系为：

PCR扩增反应的反应程序为：94℃预变性4min，1个循环；94℃变性30s，57-68℃退火30s，72℃1min,35个循环；72℃5min。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（二）5'RACE克隆技术获得柳枝稷PvCCoAOMT基因5'RACE的cDNA片段，包括如下步骤：

（1）提取柳枝稷总RNA并进行RNA完整性和纯度检测；

（2）5'RACE第一链cDNA的合成；

（3）设计5'RACE基因的上下游特异引物：

上游引物UPM为通用引物10×Universal Primer A Mix，是长引物Long和短引物Short的混合物，其中：

Long:5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；

Short:5’-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’；

下游引物GSP1：5'-CCGGCCTTCTCGATGCAGGGCAGG-3'；

（4）以步骤（2）获得的cDNA为模板，以步骤（3）设计的引物为引导进行降落PCR反应；

（5）回收和纯化步骤（4）扩增的PCR产物；

（6）PCR产物与T载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞；

（7）筛选阳性克隆，并进行序列测定与分析，获得柳枝稷PvCCoAOMT基因5'RACE的cDNA片段。