[发明专利]一种用于何首乌及其中药制剂肝毒性评价的生物毒性效价检定方法

权利要求书

1.一种用于评估何首乌及其中药制剂肝毒性的生物毒性效价检定方法，所述生物毒性效价检定方法包括下述步骤：

a.配制供试品溶液和供试品稀释液

制备何首乌或其固体制剂的干浸膏；

在测定前，用细胞培养液将所述干浸膏配置成供试品溶液，过滤除菌，备用；

测定时，估计供试品毒性效价，用所述细胞培养液稀释所述供试品溶液，得到不同浓度的供试品稀释液；

其中所述干浸膏如下制备：

称取何首乌或其固体制剂形式的供试品粉末，用乙醇浸泡，超声处理，过滤，得到的滤液减压浓缩，真空干燥，制得干浸膏；

b.配制对照品溶液和对照品稀释液

用所述细胞培养液将具有肝细胞毒性的对照品配制成对照品溶液，过滤除菌，贮存，备用；

测定时，用所述细胞培养液稀释所述对照品溶液，得到不同浓度的对照品稀释液；

c.测定

以肝细胞作为供试细胞，将所述肝细胞接种于细胞培养板中，并在培养箱内培养12～48小时，吸出细胞培养液，加入所述对照品稀释液或所述供试品稀释液，放入培养箱内孵育，之后吸出培养板内的所述对照品稀释液或供试品稀释液，计算细胞抑制率；

d.生物毒性效价计算

对细胞抑制率进行数据转换，并将转换结果作为评价指标，按照中国药典2010版二部附录XIV生物检定统计法中的量反应平行线二剂量法计算毒性效价及实验误差，可信限率FL％不超过40％；

其中，优选地采用三次方对细胞抑制率进行数据转换；优选地，可信限率FL％不超过20％；

其中，所述细胞培养液是在常规方法中用于培养肝细胞的细胞培养液。

2.根据权利要求1所述的生物毒性效价检定方法，其中，在步骤a中：

所述供试品粉末预先过10～100目筛；

所述乙醇是体积百分数为5～95％的乙醇，优选地，所述乙醇是体积百分数为50％的乙醇；

所述浸泡提取的时间为30～60分钟，超声处理的时间为15～60分钟；

供试品溶液贮存温度为4℃；

所述过滤除菌是用孔径为0.2μm的微孔滤膜来过滤除菌；

所述供试品溶液为10.00mg/ml～20.00mg/ml的溶液。

3.根据权利要求1所述的生物毒性效价检定方法，其中，在步骤b中：

所述对照品溶液为5.00mg/ml～10.00mg/ml的溶液；

对照品溶液贮存温度为4℃；

所述过滤除菌是用孔径为0.2μm的微孔滤膜来过滤除菌。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的生物毒性效价检定方法，其中，步骤c中的所述肝细胞为人正常肝细胞L02细胞系或鼠原代肝细胞，优选地为人正常肝细胞L02细胞系。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的生物毒性效价检定方法，其中，步骤c中的细胞接种浓度为1.8×10⁴～1.4×10⁵个/ml，优选地，步骤c中的细胞接种浓度为3.5×10⁴个/ml。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的生物毒性效价检定方法，其中，步骤b中的所述具有肝细胞毒性的对照品为对乙酰氨基酚。

7.根据权利要求1-3中任一项所述的生物毒性效价检定方法，其中，在步骤c中，加入对照品稀释液或供试品稀释液后，在培养箱内孵育的时间为24～48小时，优选地孵育时间为24小时。

8.根据权利要求1-3中任一项所述的生物毒性效价检定方法，其中所述细胞培养液由1640培养液、胎牛血清和10000U/ml的青链霉素配置而成，优选地，所述细胞培养液中的1640培养液、胎牛血清和10000U/ml的青链霉素的体积百分数分别为89％、10％和1％。

9.根据权利要求1-3中任一项所述的生物毒性效价检定方法，其中，在步骤c中，所述对照品稀释液是1.01mg/ml～3.18mg/ml的对乙酰氨基酚溶液，优选地，所述对照品稀释液是1.79mg/ml和2.39mg/ml的对乙酰氨基酚溶液。

10.根据权利要求1-3中任一项所述的生物毒性效价检定方法，其中，在步骤c中，所述供试品稀释液是1.90mg/ml～6.00mg/ml的溶液，优选地，所述供试品稀释液是2.53mg/ml和3.38mg/ml的溶液。

11.根据权利要求1所述的生物毒性效价检定方法，其中，在步骤c中，所述细胞抑制率的检测方法为CCK-8法或MMT法，优选地，所述细胞抑制率的检测方法为CCK-8法。