[发明专利]一种用于何首乌及其中药制剂肝毒性评价的生物毒性效价检定方法

说明书

技术领域

本申请涉及一种用于何首乌及其中药制剂肝毒性评价的生物毒性效价检定方法。

背景技术

何首乌是常用的传统补益类中药，为祖国草药中的四大仙草之一。何首乌作为一种常见的补益类中药，不论单用、配伍还是处方、非处方以及保健品的应用都非常的广泛。在民间何首乌流传为补肝肾、乌须发、乃至长生不老的仙药，在一定程度上夸大了何首乌的功效，而其可能引发肝损伤的风险却很少受到重视，因而近年来国内外相继出现了何首乌肝毒性与不良反应的报道。

《中华人民共和国药典》收载何首乌及其炮制加工品制何首乌，生首乌具有解毒、消痈、润肠通便的功效。制何首乌性补益精血、乌须发、强筋骨、补肝肾等功效，制首乌的肝毒性较生首乌轻，但是仍然存在有一定程度的损害，临床上的应用也主要以制首乌为主。何首乌的炮制方法较多，药典收载何首乌的炮制方法有清蒸法、黑豆汁蒸法和黑豆汁炖法。目前市场上制何首乌的质量参差不齐，其炮制方法及炮制时间是否符合药典规定尚未可知，这大大增加了何首乌引发肝损伤的风险。因此，何首乌的质量控制成为其临床安全应用的重要前提。

目前何首乌质量控制方法主要是用高效液相色谱法测定二苯乙烯苷和蒽醌的含量。但由于何首乌毒性物质不明确，因此通过化学成分分析法并不能有效地表征何首乌的肝毒性。因此，需要一种能够直观地标示出何首乌的总毒性大小，保障临床用药安全性的毒性生物检测方法。

发明内容

本申请的目的是提供一种用于评估何首乌及其中药制剂肝毒性的生物毒性效价检定方法。

毒性效价(toxic potency)检定方法是以中药产生的毒性为基础，融入定量药理学与药检分析的双重属性和要求来表征中药安全性的一种实验方法，从而为其质量控制提供依据。在检测何首乌及其中药制剂肝细胞毒性时，细胞抑制率的结果主要是重现其肝细胞毒性的趋势和规律，不一定要重现试验数据的绝对值，重在证实试验结果与对照组比较是否具有显著性差异及统计学意义；而毒性效价的检测则要求重现试验数据的绝对值，同时还需确定线性范围，并考察精密度、重现性、甚至回收率，因此毒性效价的检定较单纯的抑制率检测重现性好，能够更为准确可靠的评价何首乌及其中药制剂的质量，保证临床安全用药。

具体地，本申请提供了一种用于评估何首乌及其中药制剂肝毒性的生物毒性效价检定方法，所述生物毒性效价检定方法包括下述步骤：

a.配制供试品溶液和供试品稀释液

制备何首乌或其固体制剂的干浸膏；

在测定前，用细胞培养液将所述干浸膏配置成供试品溶液，过滤除菌，备用；

测定时，估计供试品毒性效价，用所述细胞培养液稀释供试品溶液，得到不同浓度的供试品稀释液；

其中所述干浸膏如下制备：

称取何首乌或其固体制剂形式的供试品粉末，用乙醇浸泡，超声处理，过滤，得到的滤液减压浓缩，真空干燥，制得干浸膏，计算收率；

b.配制对照品溶液和对照品稀释液

用所述细胞培养液将具有肝细胞毒性的对照品配制成对照品溶液，过滤除菌，贮存，备用；

测定时，用所述细胞培养液稀释对照品溶液，得到不同浓度的对照品稀释液；

c.测定

以肝细胞作为供试细胞，将所述肝细胞接种于细胞培养板中，并在培养箱内培养12～48小时，吸出细胞培养液，加入所述对照品稀释液或所述供试品稀释液，放入培养箱内孵育，之后吸出培养板内的对照品稀释液或供试品稀释液，计算细胞抑制率；

d.生物毒性效价计算

对细胞抑制率进行数据转换，并将转换结果作为评价指标，按照中国药典2010版二部附录XIV生物检定统计法中的量反应平行线二剂量法计算毒性效价及实验误差，可信限率FL％不超过40％。

其中，所述细胞培养液是在常规方法中用于培养肝细胞的细胞培养液。

其中，估计供试品毒性效价的方法可以通过检测供试品在一个大的剂量范围内的细胞抑制率的预实验来进行，所述预实验如上文的步骤c所述的方法。

在一些实施方式中，所述细胞培养液可以由1640培养液、胎牛血清和10000U/ml的青链霉素配置而成。

在一些实施方式中，所述细胞培养液中的1640培养液、胎牛血清和10000U/ml的青链霉素的体积百分数可以分别为89％、10％和1％。