[发明专利]利用非标记功能核酸形成G-四联体荧光法检测铅的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种水质检测技术领域的方法，具体是一种利用非标记功能核酸形成G-四联体荧光法检测铅的方法。

背景技术

铅是一种严重危害人类健康的重金属元素，具有持久性、易迁移性和高度的生物富集性。进入人体的铅能破坏造血系统，阻碍血红素的合成，导致贫血；损伤大脑中枢及周围神经系统；影响消化系统功能，导致厌食；抑制生长激素的合成与释放，导致儿童发育迟缓；影响身体对其他金属元素的吸收、代谢；对肾脏损害极大，引起肾功能障碍；影响心脏正常运转，引发心肌损伤等。对于儿童，学术界已经确认，只要血铅水平超过或等于100μg／L，不管有无临床症状和体征，都可以确诊为儿童铅中毒。铅中毒会导致儿童智力下降，认知功能、神经行为和学习记忆等脑功能受损，严重者造成痴呆。因此，建立高灵敏度、高选择性的铅离子检测方法具有重要的现实意义。

传统的铅离子检测方法有原子吸收光谱法、原子发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法、原子荧光光谱法和气相色谱法，这些方法虽早已成熟并准确可靠，但在实际应用中需要昂贵复杂的仪器设备以及训练有素的技术人员，费力费时，难以满足大规模应用及实时原位检测的需要。新型的铅离子检测技术有化学传感器技术和生物传感器技术，其中功能核酸类生物传感器因具有选择性好、信号转换容易等特点而成为研究热点。用于铅检测的功能核酸通常包括两类：一类是核酸酶（DNAzyme），此类酶检测铅的原理是其底物链中包含一个核糖腺嘌呤（rA），铅离子可以特异性地从该位置将其底物链切断，通过将底物链的断裂转化成比色、化学发光和荧光等信号达到检测目的；另一类是富含鸟嘌呤（G）的单链寡核苷酸，铅离子可以促进此类寡核苷酸形成G-四联体（G-quadruplex）结构，结合G-四联体的相关特性选择合适的信号输出方法，也能达到检测铅的目的。与核酸酶相比，寡核苷酸具有合成成本低，稳定性好等特点，因而逐渐受到广泛关注。

荧光法是一种简便、快速、灵敏的检测方法，已结合功能核酸（尤其是单链寡核苷酸）被用来检测多种物质，关于铅离子的检测也有报道，但这些方法或需要用荧光基团标记功能核酸，或涉及复杂的催化反应。而利用非标记功能核酸形成G-四联体荧光法检测铅的方法较少见报道。

经过对现有技术的检索发现，高晓霞于《基于核酸探针的汞离子和铅离子检测》（《湖南大学》2011年）中公开了三种基于核酸探针的汞离子和铅离子的检测方法:(1)基于环糊精/芘协同作用荧光检测汞离子(Hg～(2+))。实验设计了一条茎部含有错配胸腺嘧啶(T)碱基对,两端分别标记芘分子的DNA探针。在Hg～(2+)存在下,探针分子通过形成T-Hg～(2+)-T结构以及γ-环糊精的协同作用,产生芘分子的二聚体荧光信号。在优化的实验条件下,传感体系的响应信号在Hg～(2+)浓度为0.5μM至3.0μM的范围内呈良好的线性关系,检出限为0.3μM。此方法具有良好的选择性,同时基于芘分子二聚体荧光长寿命的特点,利用时间分辨技术,有望应用于复杂生物样品Hg～(2+)检测。(2)基于脱氧核酶(DNAzyme)免标记比色检测铅离子(Pb～(2+))。实验设计了一条包含DNAzyme以及富鸟嘌呤碱基(G)链的发夹型结构的核酸探针,通过Pb～(2+)作用后,将DNAzyme中底物链释放出来,形成G-四链体引发显色反应,通过吸收信号的响应来达到检测Pb～(2+)的目的。体系的响应信号在Pb～(2+)浓度为5nM至100nM的范围内呈良好的线性关系,检出限可以达到3nM。此外,该方法还具有良好的选择性。(3)基于脱氧核酶免标记荧光检测铅离子。利用DNAzyme可以在Pb～(2+)的作用下,发生特异性的断裂以及SYBR Green I(SG)与双链DNA杂交体间的嵌入作用,使得互补配对的双链与单链DNA产生不同的荧光信号,对Pb～(2+)进行检测。体系的响应信号在Pb～(2+)浓度为1μM至8μM的范围内呈良好的线性关系,检出限可以达到0.6μM。但该技术的缺陷或不足在于：(1)检测汞离子的DNA探针需要标记，这在一定程度上增加了成本；(2)其检测效果很大程度上依赖DNA探针中双链的存在，而双链的形成需要增加前期退火步骤并严格控制检测体系，不利于应用于实验室之外的实际检测；(3)检测铅离子的探针中存在核糖腺嘌呤rA，这除了会增加合成成本外，还会增加探针的不稳定性，导致不易保存。

发明内容