[发明专利]4H‑[1]‑苯并吡喃[4,3‑b]噻吩‑2‑甲酸酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光检测中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及糖蛋白特异性荧光检测技术，具体地说是4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光检测中的应用。

背景技术

蛋白质糖基化修饰在生命科学研究领域具有至关重要的作用，作为最主要和普遍的蛋白质翻译后修饰之一，目前已知哺乳动物蛋白质中至少有二分之一发生了糖基化，这些糖蛋白广泛分布于组织、细胞、体液中，特别是在细胞膜表面、体液等中含量丰富，糖基化对于蛋白质的折叠、运输和定位等都起着重要作用，并参与受体激活、信号转导、细胞载附等诸多重要的生物过程。糖蛋白数量变化或糖链结构的改变，都可能导致疾病发生。不但目前已知的很多疾病的诊断标志物是糖蛋白，而且通过国际标准认证的药物中，糖蛋白也占到较高的比例。

目前糖蛋白检测领域试剂盒主要集中于外国的生物试剂公司，且多数产品均以高附加值的价格在市场销售，价格高昂，不利于生物技术基础研究的发展。尤其国内利用现有的生物试剂进行生物实验成本居高不下，无法实现经济效益与实验共同发展。本发明开发的4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物荧光染色方法灵敏度接近Pro-Q Emerald488染色法，是一种灵敏、便捷、特异的糖蛋白荧光检测技术，有较好的基础与临床意义。

发明内容

本发明的目的在于提供4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光检测中的应用。

本发明所述的4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼相关化合物是指以4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼阴离子为母核的钠盐、钾盐和铵盐等。

4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼母核为：

为了实现本发明的目的，本发明还提供了应用4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼进 行糖蛋白特异性荧光检测的方法包括如下步骤：

1)将经SDS-PAGE电泳后含蛋白质样品的凝胶置于固定液中固定10～60min，弃固定液。优选的固定时间为30min，固定液可以是含有40％乙醇和10％乙酸的水溶液；

2)在高碘酸溶液里氧化10～40min，其中高碘酸溶液为含重量体积比0.1～1％的高碘酸及按体积比0.5～5％的乙酸水溶液。然后用按体积比0.5～5％的乙酸水溶液冲洗2～5次，每次1～10min；优选的氧化时间为20min，优选的氧化液组成为含重量体积比0.5％的高碘酸及按体积比1％的乙酸水溶液；

3)加入染色液1～40min，其中染色液为含重量体积比0.0001～0.001％的4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼或其衍生物及按体积比0.5～5％的乙酸水溶液。优选的染色时间为10min，优选的染色液组成为含重量体积比0.0002％的4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及按体积比1％的乙酸水溶液；

4)加入洗脱液，洗脱液组成为体积比0.5～5.0％的乙酸，10～70％乙醇及0.5～2％乙醇胺水溶液，洗脱1～3次，每次1～10min。优选的洗脱时间为20min，优选的洗脱液组成为按体积比1.0％乙酸，40％乙醇及1％乙醇胺水溶液；

5)检测，可在激光扫描仪下观察染色后的糖蛋白。

前期研究表明该技术有如下优点：

1)灵敏度高：4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼糖蛋白特异性荧光检测法灵敏度同Pro-Q Emerald488灵敏度相当；

2)操作简单迅速：操作步骤少，可在2个小时内完成；

3)重现性好：受温度、摇床摆动频率等外部条件影响较小；

4)可逆性好：容易脱色；

5)质谱兼容性好：由于4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼荧光检测法不影响蛋白质结构，所以可与MALDI-TOF等质谱仪高度兼容；

6)使用安全：采用毒性低的染料，提高实验操作的安全性，对环境污染小；

7)成本低。

附图说明

图1.4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼的化学结构；