[发明专利]含有内标的金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及食品安全的检测方法，具体涉及金黄色葡萄球菌LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法，该试剂盒可根据内标检测结果判断检测结果是否为假阴性。

背景技术

金黄色葡萄球菌是一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。

金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到，食品极易被污染。据美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。一般来说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品：食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。

为了寻求快速、准确、简便、微量的检验方法,国内外学者进行了大量的研究,从以传统方法为基础发展到以免疫学为基础的或以分子生物学为基础的快速检测方法,并在实践检验中不断取得新进展。

目前，包括我国在内的许多国家对金黄色葡萄球菌的检测普遍采用传统培养方法，报告检验结果大致需4～5d，加之检测方法繁琐、费时费力，不仅成为检验部门的一项沉重负担，而且越来越不能满足日益发展的国际贸易的需要。20世纪50年代以来，为了寻求快速、准确、简便、微量的检测方法，国内外学者进行了大量的研究，从以传统方法为基础发展到以免疫学为基础的或以分子生物学为基础的快速检测方法，并在实践检验中不断取得新进展。

以抗体为基础的ELISA方法和免疫荧光标记方法将检测时间缩短了一半，灵敏性高但特异性差；以核酸为基础的PCR技术由于灵敏、简单、快速和特异已被广泛用于金黄色葡萄球菌检测，但检测样品复杂，对假阴性的检测结果没有控制，存在漏检的可能。因金黄色葡萄球菌危害严重，漏检造成的危害无法估量。但PCR扩增需要昂贵的仪器，很多基层检测单位不具备相应检测条件。因此，建立一种快速、准确、高通量且对仪器要求不高的的检测试剂盒及检测方法成为目前急需解决的问题。

本发明采用环介导等温扩增技术，在恒温条件下实现对靶标基因的扩增，通过加入内标，可有效的检测到假阴性的检测结果。同时环介导等温扩增技术整体检测成本低，有利于基层的推广与应用。

金黄色葡萄球菌作为食品卫生检验一项重要目的菌有着重要的意义，提高金黄色葡萄球菌检出率,缩短检测时间，防止因样品复杂性、抑制因子多等原因等抑制反应而发生漏检的现象发生，对保证食品的安全性和消费者的身体健康具有重要的意义。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物，包含检测引物组及内标引物组。可根据检测内标引物组是否有扩增来判断是否有假阴性检测结果。为目前无法判断检测结果是否是假阴性结果的情况，提供一种新的LAMP检测方法。不仅降低检测成本，摆脱对昂贵仪器的依赖，同时提高检测的准确性。

本发明的另一个目的在于提供一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法。

本发明所采用的技术方案如下：

一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，包含检测引物组及内标引物组。可根据检测内标引物组是否有扩增来判断是否有假阴性检测结果。检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

SAnuc-F3：ACAAACAGATAACGGCGTAA（SEQ ID NO:1）；

SAnuc-B3：CCAAGCCTTGACGAACTAA（SEQ ID NO:2）；

SAnuc-FIP：AGGATGCTTTGTTTCAGGTGTAAGCGATTGATGGTGATACG（SEQ ID NO:3）；

SAnuc-BIP：GCCCTGAAGCAAGTGCATTTACGCATAAATATACGCTAAGCCAC（SEQ ID NO:4）；

SAnuc-LF：TCTGAATGTCATTGGTTGACCT（SEQ ID NO:5）；