[发明专利]含有内标的金黄色葡萄球菌的LAMP检测引物、试剂盒及检测方法有效
| 申请号： | 201310268829.5 | 申请日： | 2013-06-28 |
| 公开（公告）号： | CN103361429A | 公开（公告）日： | 2013-10-23 |
| 发明（设计）人： | 石磊;王珊珊;张志刚;苏永裕;孟赫诚;闫鹤 | 申请（专利权）人： | 厦门银祥集团有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12Q1/14;C12N15/11 |
| 代理公司： | 厦门市首创君合专利事务所有限公司 35204 | 代理人： | 张松亭 |
| 地址： | 361000 福建省厦门*** | 国省代码： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 含有 标的 金黄色 葡萄球菌 lamp 检测 引物 试剂盒 方法 | ||
1.一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测方法，使用了检测引物组及内标引物组，可根据检测内标引物组是否有扩增来判断是否有假阴性检测结果，其中，检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
SAnuc-F3：ACAAACAGATAACGGCGTAA（SEQ ID NO:1）；
SAnuc-B3：CCAAGCCTTGACGAACTAA（SEQ ID NO:2）；
SAnuc-FIP：AGGATGCTTTGTTTCAGGTGTAAGCGATTGATGGTGATACG（SEQ ID NO:3）；
SAnuc-BIP：GCCCTGAAGCAAGTGCATTTACGCATAAATATACGCTAAGCCAC（SEQ ID NO:4）；
SAnuc-LF：TCTGAATGTCATTGGTTGACCT（SEQ ID NO:5）；
SAnuc-LB：GAAGTCGAGTTTGACAAAGGTC（SEQ ID NO:6）；
内标引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
SAfemA2-F3：CGCATAACAAGCGAGATAAC（SEQ ID NO:7）；
SAfemA2-B3：AGCATCTTCAGCATCTTCTG（SEQ ID NO:8）；
SAfemA2-FIP：TGCATTTGATGTACCACCAGCACGTCTACAAGAAGAACATGGT（SEQ ID NO:9）；
SAfemA2-BIP：TCCGTCATTTTGCCGGAAGTTATAACGGTCAATGCCATGATT（SEQ ID NO:10）；
SAfemA2-LF：GAAGAAACCAGCAGAGATAGGT（SEQ ID NO:11）；
SAfemA2-LB：GCAGTGCAATGGGAAATGATTA（SEQ ID NO:12）。
2.用于检测金黄色葡萄球菌的引物，其特征在于，引物包括权利要求1中所述的检测引物组和内标引物组。
3.一种金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，检测试剂盒包括权利要求1所述的检测引物组和内标引物组。
4.根据权利要求3所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分：（1）权利要求1所述的引物组；（2）内标靶标片段；（3）DNA聚合酶；（4）LAMP反应液；（5）阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求4所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于检测引物组及内标引物组，引物浓度的比例如下：外引物、内引物、环引物的摩尔比为：1-2：4-8：2-4。
6.根据权利要求4所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
7.根据权利要求4所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述LAMP反应液含有：8mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、120mM MgSO4水溶液、三者的体积比是7：4：3。
8.根据权利要求4所述的金黄色葡萄球菌的LAMP检测试剂盒，其特征在于：阳性对照为含有金黄色葡萄球菌nuc基因片段的T载体克隆；阴性对照为超纯水；内标为含有金黄色葡萄球菌femA2基因片段的T载体克隆，浓度为内标引物组femA2的最低检出限10fg/μl。
9.利用权利要求3～8任一项所述的试剂盒检测金黄色葡萄球菌的方法，包括如下步骤：
（1）待检样品的提取：按照DNA提取试剂盒进行；
（2）恒温基因扩增检测反应体系及条件：25μl反应体系含有：SAnuc-F30.2μ M，SAnuc-B30.2μM，SAnuc-FIP1.6μM，SAnuc-BIP1.6μM，SAnuc-LF0.8μM，SAnuc-LB0.8μM，LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，10×SYBR Green I0.5μl，待检样品2μl，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63～65℃反应30～60min，并在80℃持续2min；
（3）恒温基因扩增内标反应体系及条件：25μl反应体系含有：SAfemA2-F30.2μM，SAfemA2-B30.2μM，SAfemA2-FIP1.6μM，SAfemA2-BIP1.6μM，SAfemA2-LF0.8μM，SAfemA2-LB0.8μM，LAMP反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，10×SYBR Green I0.5μl，待检样品2μl，内标2μl，用超纯水补齐到25μl；设置阳性对照和阴性对照；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63～65℃反应30～45min，并在80℃持续2min；
（4）结果判断：将上述反应管中置于ESE-Quant Tube Scanner或荧光PCR仪中，根据仪器实时读取的荧光信号来判断扩增结果；根据nuc基因检测结果和内标基因femA2检测结果进行判断：
nuc基因检测结果与内标基因检测结果全为阳性时，检测结果为阳性；
nuc基因检测结果为阴性，内标基因检测结果为阳性时，检测结果为阴性；
nuc基因检测结果为阳性，内标基因检测结果全为阴性时，检测结果为阳性；
nuc基因检测结果为阴性，内标基因检测结果为阴性时，检测结果可能为假阴性，建议重新提取DNA进行检测或采用其他方法检测。
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