[发明专利]含内标的单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于食品安全的分子生物学检测方法领域，特别涉及一种含内标的单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒。

背景技术

单核细胞增生李斯特氏菌是是李斯特菌属中的一种，广泛分布于自然界，在肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品和蔬菜类都能检出，其感染严重时可引起血液和脑组织疾病，是引起动物和人类疾病的重要致病菌。

单核细胞增生李斯特氏菌是李斯特菌属中致病力最强的细菌，也是迄今发现唯一能对人致病的、典型的胞内寄生菌，能在巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞和肝细胞内增殖。目前发现LM染色体基因有2个毒力岛，分别为李斯特菌毒力岛1（LIPI-1）和李斯特菌毒力岛2（LIPI-2）。LIPI-1有6个基因，分别为prfA、plcA、hlY、mpI、actA、plcB。LIPI-2为内化素小岛，有inIAB基因和inIC基因，分别编码不同的致病物质。它能引起人和动物患脑膜炎、脑炎、败血症、心内膜炎、流产、脓肿和局部的脓性损伤，可造成孕妇流产、死胎等疾病，发病者死亡率可达20%～70%。人类李斯特菌病感染对象主要是新生儿、孕妇、老年人和免疫功能低下者，免疫正常人群很少感染。其在4℃的环境下仍能生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要的重要致病菌。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患的致病菌，也是重要的食源性致病菌。近年来，单核细胞增生李斯特氏菌在法国、美国、加拿大和德国等国曾多次引起食物中毒，轻者为一般胃肠炎症状，重症者主要表现为败血症、脑膜炎、神经症状及单核细胞增多等，临床死亡率高达20%～70%。

为了寻求快速、准确、简便、微量的检验方法，国内外学者进行了大量的研究，从以传统方法为基础发展到以免疫学为基础的或以分子生物学为基础的快速检测方法,并在实践检验中不断取得新进展。

目前，包括我国在内的许多国家对单核细胞增生李斯特氏菌的检测普遍采用传统培养方法，报告检验结果大致需4～5d，加之检测方法繁琐、费时费力，不仅成为检验部门的一项沉重负担，而且越来越不能满足日益发展的国际贸易的需要。20世纪50年代以来，为了寻求快速、准确、简便、微量的检测方法，国内外学者进行了大量的研究，从以传统方法为基础发展到以免疫学为基础的或以分子生物学为基础的快速检测方法，并在实践检验中不断取得新进展。

以抗体为基础的ELISA方法和免疫荧光标记方法将检测时间缩短了一半，灵敏性高和但特异性差；以核酸为基础的PCR技术由于灵敏、简单、快速和特异已被广泛用于单核细胞增生李斯特氏菌检测，但检测样品复杂，对假阴性的检测结果没有控制，存在漏检的可能。因单核细胞增生李斯特氏菌危害严重，漏检造成的危害无法估量。但PCR扩增需要昂贵的仪器，很多基层检测单位不具备相应检测条件。因此，建立一种快速、准确、高通量且对仪器要求不高的的检测试剂盒及检测方法成为目前急需解决的问题。

单核细胞增生李斯特氏菌作为食品卫生检验一项重要目的菌有着重要的意义，提高单核细胞增生李斯特氏菌检出率，缩短检测时间，防止因样品复杂性、抑制因子多等原因抑制反应而发生漏检的现象发生，对保证食品的安全性和消费者的身体健康具有重要的意义。

发明内容

为克服上述现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种含内标的单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物组，包含检测引物组及内标引物组。

本发明的另一目的在于提供包含上述检测引物组的含内标的单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒。可根据试剂盒内的检测内标引物组是否有扩增来判断是否有假阴性检测结果。为目前无法判断检测结果是否是假阴性结果的情况，提供一种新的LAMP检测方法。不仅降低检测成本，摆脱对昂贵仪器的依赖，同时提高检测的准确性。

本发明的再一目的在于提供上述的LAMP检测试剂盒检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法。本发明的检测方法采用环介导等温扩增技术，在恒温条件下实现对靶标基因的扩增，通过加入内标，可有效的检测到假阴性的检测结果。同时环介导等温扩增技术整体检测成本低，有利于基层的推广与应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种含内标的单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物组，包含检测引物组及内标引物组。可根据检测内标引物组是否有扩增来判断是否有假阴性检测结果。

检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

LMhly-F3：ATTAGTATACCACGGAGATGC；

LMhly-B3：TCCACTAATGTATTTACTGCGT；

LMhly-FIP：