[发明专利]含内标的单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒

权利要求书

1.一种含内标的单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物组，其特征在于包含检测引物组及内标引物组；

所述的检测引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

LMhly-F3：ATTAGTATACCACGGAGATGC；

LMhly-B3：TCCACTAATGTATTTACTGCGT；

LMhly-FIP：

GAATTCGCTTTCACGAGAGCGCAGATATCCAAGTTGTGAATG；

LMhly-BIP：

CAACCCGATGTTCTTCCTGTCACTTGATTAGTCATTCCTGGCA；

LMhly-LF：ACCTGGATATGTTAGGCTCG；

LMhly-LB：CGTGATTCATTAACACTTAGCA；

所述的内标引物组包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：

LMprfA-F3：TGAACGCTCAAGCAGAAG；

LMprfA-B3：AGCTAGACTGTATGAAACTTGT；

LMprfA-FIP：

TGATGGTCCCGTTCTCGCTACCAATGGGATCCACAAGAAT；

LMprfA-BIP：

TGATACAGAAACATCGGTTGGCTTGATAACGTATGCGGTAGC；

LMprfA-LF：TACTCGTGAGCTTTGTGATACC；

LMprfA-LB：TTAGAAGTCATTAGCGAGCAG。

2.一种含内标的单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒，其特征在于由以下成分组成：权利要求1所述的含内标的单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物组；DNA聚合酶；LAMP反应液；核酸荧光染料；内标；阳性对照和阴性对照；

所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶；

所述LAMP反应液含有8mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液和120mMMgSO₄水溶液三种成分；

所述的核酸荧光染料为10×SYBR Green I；

所述的内标为含有单核细胞增生李斯特氏菌prfA基因片段的T载体克隆；

所述的阳性对照为含有单核细胞增生李斯特氏菌LMhly基因片段的T载体克隆；

所述的阴性对照为超纯水。

3.根据权利要求2所述的含内标的单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的含有单核细胞增生李斯特氏菌prfA基因片段的T载体克隆通过下述方法制备：以分离鉴定的单核细胞增生李斯特氏菌为模板，利用内标引物组的外引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8进行扩增，所得prfA基因扩增片段序列，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，获得含有单核细胞增生李斯特氏菌prfA基因片段的T载体克隆。

4.根据权利要求2所述的含内标的单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的含有单核细胞增生李斯特氏菌LMhly基因片段的T载体克隆通过下述方法制备：以分离鉴定的单核细胞增生李斯特氏菌为模板，利用检测引物组的外引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2进行扩增，所得hly基因扩增片段序列，回收该扩增片段，利用常规方法连接到T载体中，即为含有单核细胞增生李斯特氏菌LMhly基因片段的T载体克隆。

5.根据权利要求2所述的含内标的单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的含内标的单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物组中，检测引物组及内标引物组的引物浓度比例为：外引物、内引物、环引物的摩尔比为：1-2：4-8：2-4。

6.根据权利要求2所述的含内标的单核细胞增生李斯特氏菌LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述LAMP反应液中8mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液和120mM MgSO₄水溶液三者的体积比是7：4：3。