[发明专利]一种向树突状细胞DC靶向加载肿瘤抗原肽的方法

说明书

技术领域

本发明属于医疗技术领域，特别是肿瘤生物技术中用于治疗肿瘤抗原靶向加载的方法。 

背景技术

肿瘤生物治疗是继手术、放疗和化疗后发展的第四类癌症治疗方法，系利用机体激发的免疫反应来对抗、抑制和杀灭癌细胞。与传统的治疗方法不同，肿瘤生物治疗是以现代分子生物学、细胞生物学和分子免疫学等前沿科学为基础，利用机体对肿瘤的免疫应答，通过生物手段改变肿瘤和机体之间的相互作用，调动机体对肿瘤的防御机制，达到控制肿瘤生长，延长患者生存期，提高患者生活质量的目的，其已成为肿瘤综合治疗中的重要治疗方法。   

免疫系统是人体的防御体系，一方面清除细菌、病毒等外来异物，另一方面清除体内衰老的无功能细胞以及发生突变的细胞。突变细胞进一步变为肿瘤细胞，人体免疫系统可及时识别这些肿瘤细胞，并予以清除。机体免疫系统实现这种清除功能需有两个重要的环节，一是识别(肿瘤抗原识别)，二是杀伤（清除肿瘤细胞）。识别环节主要依赖于具有抗原递呈功能的树突状细胞（DC）等细胞，杀伤环节依赖多种具有清除功能的免疫淋巴细胞。DC细胞获取肿瘤抗原是免疫系统特异性识别肿瘤细胞的关键。

经过近二十年的研究和完善，DC细胞的体外分化和激活方法已趋于成熟。但DC的肿瘤抗原加载技术还远未达成共识。因此，不同DC疫苗疗效的区别关键在于肿瘤抗原的选择及抗原加载方式。国内常用的抗原加载方法是将肿瘤匀浆与DC混合即可。这样操作的危害性在于，肿瘤抗原属于自体抗原，简单而低效率加载的自体抗原不仅不能诱导免疫反应，反而会导致免疫滞胀，结果适得其反。 

发明内容

本发明的目的是提供一种能克服以上缺陷的对树突状细胞靶向加载肿瘤抗原肽的方法。 

本发明利用抗DEC-205分子的抗体基因与编码肿瘤抗原肽MUC1的基因体外重组和表达，获得与树突状细胞DC表面DEC-205受体分子高效结合的融合蛋白V，得到对树突状细胞靶向加载的肿瘤抗原肽MUC1。 

具体步骤是： 

1）将抗DEC-205的抗体基因与编码MUC1的基因在体外合成并重组，得到保藏号CGMCC为 NO：7686的表达质粒pET41a-antiDEC-ScFV；

2）将表达质粒pET41a-antiDEC-ScFV转入大肠杆菌，经过诱导，得到表达融合蛋白V前体；

3）将融合蛋白V前体经过变性和复性后，获得具有活性功能的融合蛋白V；

4）采用生物素标记的具有活性功能的融合蛋白V与树突状细胞DC结合，用荧光标记的亲和素来检测对树突状细胞靶向加载的肿瘤抗原肽MUC1。

本发明采用一种靶向加载的方法，向成熟DC细胞表面加载肿瘤抗原肽MUC1。具有抗原递呈功能的成熟DC细胞表面具有一种特征性的受体DEC-205，因此设计一种抗DEC-205的单链抗体基因，并与编码肿瘤抗原肽MUC1的基因在体外合成并重组，然后在大肠杆菌中表达获得融合蛋白前体；融合蛋白前体经过复性后，成为具有抗体活性的融合蛋白V。该蛋白分子在N端有抗DEC-205的单链抗体，同时在C端含有肿瘤抗原肽MUC1；利用生物素标记融合蛋白V后，再与成熟的DC细胞结合和流式细胞仪检测，经采用流式细胞仪检测融合蛋白V抗体活性，确认融合蛋白V可以将肿瘤抗原肽MUC1靶向加载到成熟DC细胞表面，可有效提高DC细胞递呈肿瘤抗原的能力。 

采用对DC细胞靶向加载肿瘤抗原肽的方法，能特别高效地递呈肿瘤抗原，诱发机体针对肿瘤抗原非常高效的免疫反应，能调动、激活及扩增具有肿瘤靶向的杀伤细胞（CD8+T细胞），同时可产生长效性的记忆细胞，以达到长期的、可持续性的抗肿瘤，防复发的效果。 

本发明的有益效果是：本发明方法采用具有抗体活性的融合蛋白与DC细胞表面受体分子DEC-205紧密结合，向DC细胞靶向加载肿瘤抗原肽MUC1, 能极大提高DC细胞递呈肿瘤抗原肽MUC1的能力。 

以上步骤3）变性的目的或意义、复性的的目的或意义：本发明的融合蛋白V是采用原核生物大肠杆菌蛋白表达系统，所表达的蛋白缺乏正确的空间结构。变性过程是将影响蛋白空间结构的二硫键还原，然后在特定的条件下再将蛋白缓慢氧化，恢复二硫键和正确的蛋白空间结构，获得具有抗DEC-205活性的融合蛋白V。 

在所述步骤1）中，将抗DEC-205的抗体分子与肿瘤抗原肽MUC1重组在同一融合蛋白中。可保持抗DEC-205的抗体活性。 

在所述步骤2）中，将抗DEC-205分子的抗体基因与编码肿瘤抗原肽MUC1的基因体外重组成的核酸序列，克隆到蛋白表达质粒上，经过诱导在大肠杆菌中表达。