[发明专利]一种高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物添加剂的制备方法，尤其涉及一种高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法。 

背景技术

随着养殖业的不断发展以及粮食价格的攀升,开发品质优良、安全价廉的牧草饲料已成为转变养殖业经济增长方式的内在需求。苜蓿是草食动物优质的饲草,其主要产品是干草,但这种产品制作时常受到淋雨、落叶、价格昂贵的烘干设备以及消耗大量能源等问题的困扰，苜蓿青贮不仅可以免受以上困扰,还可减少养分损失以保持青绿饲料的营养特性。 

因此，很多技术公开了苜蓿青贮的方法，但由于苜蓿自身的营养特征和菌落特征导致现有公开的技术或方法中苜蓿青贮的效果不理想，主要问题在于：一、一部分技术要求青贮时，,需要苜蓿萎蔫或晾晒至65%以下的含水量,这种含水量的要求将导致面临收获的雨季苜蓿无法进行青贮；二、苜蓿自身附有大量的酵母菌和少量的乳酸菌，,苜蓿在青贮过程中需要使用繁殖快、抑菌强的乳酸菌添加剂，但添加乳酸菌剂的苜蓿青贮品在饲喂动物时将进入食物链，降低抗生素抗性的风险,需评价乳酸菌剂的抗生素抗性,即乳酸菌剂对抗生素的敏感性试验。    

鉴于上述苜蓿青贮用乳酸菌添加剂存在的问题以及苜蓿青贮时的特征,现有技术不能同时完成对高水分含量苜蓿进行青贮,同时提高青贮剂的抑菌效果和降低耐药性借助青贮苜蓿进入食物链而传播的隐患的问题。

发明内容

为解决现有技术中的不足，本发明目的在于提供一种高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法。 

本发明为达到上述目的，所采用的技术手段是：一种高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法，其活性成分为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WN5和干酪乳杆菌SN3(Lactobacillus casei)。 

上述活性成分的制备方法是： 

一、菌株的分离和纯化：收集淤泥的浸出液，按体积比1:10的比例加入到无菌水中混匀，连续稀释,将各个稀释度的菌液100微升分别涂布在MRS固体培养基中,37℃厌氧培养48h；挑取透明圈较大的单菌落，在MRS固体培养基上连续划线3次得到纯的单菌落；挑取单菌落于没有添加碳酸钙的MRS液体培养基中,观察是否产气,产气菌株为异型发酵乳酸菌,不产气菌株为同型发酵乳酸菌；共分离出175个纯化的同型和异型发酵乳酸菌株；这些菌株接入MRS液体培养基中, 37℃厌氧培养20h,取其中的700微升菌液并加入300微升灭菌甘油,然后混匀,-20℃冻存；

二、抑酵母试验：取出-20℃条件下保存的乳酸菌,取5微升注入MRS固体培养基上涂布, 在温度37℃的条件下培养12～14h；用接种环挑取MRS固体培养基上的单菌落,接种于装有5mlMRS培养基的10ml试管中,在温度37℃的条件下培养16～18h，得到活化的乳酸菌；按1%的接种量, 将活化的乳酸菌接入不含碳酸钙MRS液体培养基的250ml三角瓶中,装液量为100ml，37℃培养16～18h,此时,每毫升MRS液体培养基中至少含有0.993 × 10¹⁰ cfu乳酸菌；5000转离心5min,收集上清液,获得抑菌物一；按1%的接种量, 将活化的乳酸菌接入装有MRS液体培养基的250 ml三角瓶中,装液量为100 ml；37℃培养16～18h, 此时,每毫升MRS液体培养基中至少含有1.0×10¹⁰ cfu乳酸菌；5000转离心5min,收集上清液,获得抑菌物二；将酵母菌Saccharomyces cerevisiae于YPD液体培养基中28℃静止培养48h得到酵母菌培养液；双层琼脂平板打孔法测定上述抑菌物一的抑菌能力，双层琼脂平板打孔法测定上述抑菌物二的抑菌能力； 

三、菌株的药敏试验：制备不同浓度的抗生素滤纸片，培养乳酸菌，采用滤纸片扩散法测定乳酸菌的药敏性，得到6株对抗生素敏感且对酵母菌抑制效果好的菌株；

四、菌株的共同培养试验：取出-20℃条件下保存的6株乳酸菌进行活化，将活化的6株乳菌液按cfu比1:1的比例混合，得到进行菌株共同培养的种子液,按1%的接种量,将混合后的上述种子液接种于不含碳酸钙的MRS液体培养基，37℃静止培养,间隔1天测菌液浓度和培养基pH值,连续测定7天，菌株WN5和SN3的组合表现出最好的增殖优势和存活优势；

五、菌株的鉴定：将上述步骤筛选得到的菌株WN5和SN3分别进行生物学特性和16S-23S rDNA间隔区序列鉴定。