[发明专利]一种高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法

权利要求书

1.一种高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法，其特征在于：活性成分为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WN5和干酪乳杆菌SN3(Lactobacillus casei)。

2.根据权利要求1所述的高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法，其特征在于：所述活性成分的制备方法是：

一、菌株的分离和纯化：收集淤泥的浸出液，按体积比1:10的比例加入到无菌水中混匀，连续稀释,将各个稀释度的菌液100微升分别涂布在MRS固体培养基中,37℃厌氧培养48h；挑取透明圈较大的单菌落，在MRS固体培养基上连续划线3次得到纯的单菌落；挑取单菌落于没有添加碳酸钙的MRS液体培养基中,观察是否产气,产气菌株为异型发酵乳酸菌,不产气菌株为同型发酵乳酸菌；共分离出175个纯化的同型和异型发酵乳酸菌株；这些菌株接入MRS液体培养基中, 37℃厌氧培养20h,取其中的700微升菌液并加入300微升灭菌甘油,然后混匀,-20℃冻存；

二、抑酵母试验：取出-20℃条件下保存的乳酸菌,取5微升注入MRS固体培养基上涂布, 在温度37℃的条件下培养12～14h；用接种环挑取MRS固体培养基上的单菌落,接种于装有5mlMRS培养基的10ml试管中,在温度37℃的条件下培养16～18h，得到活化的乳酸菌；按1%的接种量, 将活化的乳酸菌接入不含碳酸钙MRS液体培养基的250ml三角瓶中,装液量为100ml，37℃培养16～18h,此时,每毫升MRS液体培养基中至少含有0.993 × 10¹⁰ cfu乳酸菌；5000转离心5min,收集上清液,获得抑菌物一；按1%的接种量, 将活化的乳酸菌接入装有MRS液体培养基的250 ml三角瓶中,装液量为100 ml；37℃培养16～18h, 此时,每毫升MRS液体培养基中至少含有1.0×10¹⁰ cfu乳酸菌；5000转离心5min,收集上清液,获得抑菌物二；将酵母菌Saccharomyces cerevisiae于YPD液体培养基中28℃静止培养48h得到酵母菌培养液；双层琼脂平板打孔法测定上述抑菌物一的抑菌能力，双层琼脂平板打孔法测定上述抑菌物二的抑菌能力； 

三、菌株的药敏试验：制备不同浓度的抗生素滤纸片，培养乳酸菌，采用滤纸片扩散法测定乳酸菌的药敏性，得到16株对抗生素敏感且对酵母菌抑制效果好的菌株；

四、菌株的共同培养试验：取出-20℃条件下保存的6株乳酸菌进行活化，将活化的6株乳菌液按cfu比1:1的比例混合，得到进行菌株共同培养的种子液,按1%的接种量,将混合后的上述种子液接种于不含碳酸钙的MRS液体培养基，37℃静止培养,间隔1天测菌液浓度和培养基pH值,连续测定7天，菌株WN5和SN3的组合表现出最好的增殖优势和存活优势；

五、菌株的鉴定：将上述步骤筛选得到的菌株WN5和SN3分别进行生物学特性和16S-23S rDNA间隔区序列鉴定。

3.根据权利要求2所述的高水分苜蓿青贮菌剂活性成分的制备方法，其特征在于：步骤二中双层琼脂平板打孔法测定是指，将20ml的MRS固体培养基注入直径25cm的培养皿中,冷却1h；取6mL酵母菌培养液加到100ml冷却至45℃的YPD半固体培养基中，摇匀，并迅速倒在底层MRS培养基上；在底层MRS培养基的上面、间隔相等距离处放置3个被剪短的lml移液器Tip头；该被剪短Tip头的高为1cm,直径为0.9cm；冷却注入的YPD半固体培养基,时间为1h,此时, 制成双层培养基；取出Tip头,制成用于放置抑菌物的洞口；取相同浓度的上述乳酸菌抑菌物一,体积数为150微升, 加入其中两孔中；剩余一个作为对照,加入150微升的灭菌俄水；37℃培养48h,测定和记录乳酸菌对酵母菌的抑菌圈直径；所述YPD液体培养基每升的组分及含量为: 酵母粉10 克，蛋白胨20克，葡萄糖20克；所述YPD半固体培养基每升的组分及含量为: 酵母粉10 克，蛋白胨20克，葡萄糖20克,0.7%的琼脂粉。