[发明专利]利用Tet-off诱导表达系统高通量筛选HIV-1整合酶抑制剂的方法

说明书

技术领域

本发明属于药学领域，特别是一种利用Tet-off诱导表达系统高通量筛选HIV-1整合酶抑制剂的方法。

背景技术

HIV(Human Immunodeficiency Virus)是感染导致AIDS(Acquired Immunodeficiency Syndrome)的病毒。自从1981年首次报道以来，HIV已经导致了3300万人感染，每年有超过250万新增病例。HIV分为HIV-1和HIV-2，但是大部分感染病例是由HIV-1感染引起的。由于缺乏有效的治愈手段，目前唯一可以控制AIDS病情的疗法是HAART（Highly Active Antiretroviral therapy）。 然而，HAART需要多种针对不同靶点的药物组合同时治疗才有效果。这样的药物组合多由逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂组成。整合酶是HIV完成整合感染的必须酶，通过抑制整合酶的活性，从而阻止HIV病毒的永久感染。目前，共有11个逆转录酶抑制剂被FDA批准上市，有8个蛋白酶抑制剂获准应用于AIDS的治疗。2007年，第一个整合酶抑制剂MK0518被FDA批准上市(Nguyen,2011)。这为HAART疗法提供了更多选择。整合酶这一新的靶点也为AIDS药物研发带来了新的希望。由于HIV是RNA病毒，平均每2000-5000个碱基中即可产生1个错配，因此，艾滋病毒变异速度非常快，耐药病毒株不断出现，很多HIV感染者面临无药可选的尴尬境地。不断寻求新的抗HIV的药物及作用靶点显得意义重大。相对于逆转录酶和蛋白酶而言，以针对整合酶为靶点，开发抗艾滋病药物的思路很新颖，目前受到普遍关注。HIV-1整合酶（Integrase, IN）大小31kD,来自HIV基因组Pol基因产物的C端。整合酶负责催化病毒基因组整合到人类基因组。这对于病毒的复制非常重要。整合酶全长288aa，有三个结构域：催化核心结构域（Catalytic Core Domain, CCD ），C末端结构域(C-terminal Domain，CTD)和N末端结构域(N-terminal domain，NTD)(Cellier,2013)。催化核心结构域负责整合靶点DNA的选择。整合酶通过催化2个反应（3’加工反应和链转移反应）完成整合。第一个反应在细胞质里完成，然后整合酶，病毒DNA和多个细胞因子组成整合前复合物（Pre-integration Complex， PIC）整合前复合物被运输到细胞核里完成第二个催化反应。LEDGF/p75（Lens Epithelium-derived Growth Factor）是第一个被发现的参与这个过程的细胞因子(Malet,2012)。科学家已经揭示了整合酶催化核心结构域（CCD）和LEDGF/p75整合酶结合结构域（Integrase Binding Domain, IBD）的晶体结构（PDB ID：2B4J）。揭示的晶体结构是整合酶CCD跟IBD的二聚体。CCD单体的氨基酸168-171和第二个CCD单体的第一个和第三个α螺旋一起跟LEDGF/p75的IBD二聚体结合在一起(Cherepanov,2005)。基于报道的晶体结构，2010年，Christ 等研究人员针对整合酶和LEDGF/p75的相互作用设计了抑制HIV复制的整合酶抑制剂（LEDGINs），这一新的抗AIDS药物靶点在近年引起了广泛关注(Christ,2010)。整合酶和LEDGF/p75的相互作用是完成整合前复合物从细胞质向细胞核运输的关键。因此：阻断整合酶和LEDGF/p75的相互作用，就能阻断整合酶从细胞质像细胞核的定位，从而阻止病毒DNA整合到人类基因组。针对这一靶点进行整合酶抑制剂的研发将为HAART（ Highly Active Antiretroviral Therapy）疗法提供更多的备选药物。

Tet-off系统是一个诱导型真核表达系统。通过将外源基因克隆到特定的表达载体pTRE-2hyg, 转染HeLa Tet-Off Advanced Cells。在培养基中添加tetracycline（Tc,四环素）或者doxycycline （Dox，多西环素），外源基因被抑制表达。当移除tetracycline或者doxycycline以后，外源基因开始大量表达。Tet-off系统可以按照需要调控基因的表达或者不表达。