[发明专利]利用Tet-off诱导表达系统高通量筛选HIV-1整合酶抑制剂的方法

权利要求书

1.一种利用Tet-off诱导表达系统高通量筛选HIV-1整合酶抑制剂的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：将HIV-1整合酶基因和加强型绿色荧光蛋白基因融合克隆进真核表达载体pTRE-2hyg，插入点为多克隆位点，酶切位点BamHI和NotI之间，构建表达载体pTRE-2hyg-EGFP-IN；并通过双酶切和基因测序，对构建的载体进行鉴定；鉴定正确以后，通过转化大肠杆菌，培养细菌；通过转染级别的质粒提取试剂盒，抽提pTRE-2hyg-EGFP-IN质粒，用于细胞转染实验；

步骤二：1）取pTRE-2hyg-EGFP-IN和Lipofectamine2000，分别用Opti-MEM I 培养基稀释，室温放置5分钟；2）将二者混合、摇匀，室温放置20分钟，备用；3）稀释HeLa Tet-Off Advanced Cells到不含抗生素的培养基中，并加到细胞培养板的孔中；4）将步骤2）中的混合液加入细胞培养孔并轻轻摇晃混匀，放置在37℃含有体积百分比浓度为5% 的CO₂的培养箱培养；5）培养4小时后，弃掉培养液，用含100μg/ ml的G418和1μg/ ml的多西霉素的完全培养基继续培养；6）继续培养8小时后，进行药物筛选；弃掉培养液，用DMEM培养基洗三次，每次3分钟；7）用完全培养基稀释待检药物，加入培养孔，设立不加药物的空白对照；8）培养12小时，用质量百分比为4%的多聚甲醛固定细胞，用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察整合酶的定位情况，能抑制整合酶细胞核定位的药物判定为阳性结果；采用Hoechst33342染色指示细胞核。

2.根据权利要求1所述的利用Tet-off诱导表达系统高通量筛选HIV-1整合酶抑制剂的方法，其特征在于：Tet-off表达系统诱导表达整合酶和绿色荧光蛋白的融合蛋白，通过观察药物对融合蛋白核转位的抑制情况，筛选整合酶抑制剂；HeLa Tet-Off Advanced Cells的培养液为DMEM，DMEM培养液中添加体积百分比为10%的FBS以及体积百分比为1% 的链霉素-青霉素；在转染前24小时进行细胞传代，使细胞在转染时处于对数生长期；Lipofectamine2000介导质粒载体导入HeLa Tet-Off Advanced Cells细胞。